2013 Fiscal Year Research-status Report
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25440048
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
鍔木 基成 神戸大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00145046)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ヘムタンパク質 / 電子伝達 / 膜タンパク質 / アスコルビン酸 / 線虫 / シトクロム / 資化性酵母 / 異種発現系 |
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| Research Abstract |
線虫Caenorhabditis elegansをモデル生物として用いることによりb561タンパク質の生理機能解明を目指した。線虫には7つのb561ファミリータンパク質（Cecytb-1～Cecytb-7）が存在している。その中で他のファミリータンパク質とは異なり、C末端部分に余分な疎水性α-ヘリックスをもつため7回膜貫通構造をとると推定されているCecytb-5に関する研究を進めた。Cecytb-5タンパク質には2つのアイソフォーム（新規配列をCecytb-5-1、データベース登録済みのものをCecytb-5-2と命名）が存在することを明らかにしてる。
まずメタノール資化性酵母Pichia pastorisに対してpPICZ-Bベクターを用いた遺伝子組換えを行い、膜中に発現させたCecytb-5-1タンパク質とCecytb-5-2タンパク質の可溶化・部分精製方法を確立した。部分精製標品について酸化・還元時の可視吸収スペクトルを測定し、タンパク質の構造的差異とAsAによる還元性という機能的差異の相関について調べた。
ついでCecytb-5-2タンパク質の線虫体内における発現局在を調べるために、in situ hybridizationによりCecytb-5-2 遺伝子が転写される部位を明らかにし、次にCecytb-5-2タンパク質の親水性ループ部分に結合する特異的抗ペプチド抗体を用いて免疫染色を行い、Cecytb-5-2タンパク質が発現する器官を明らかにした。また、Cecytb-5-2タンパク質の線虫体内における生理機能を調べるために、RNA干渉（RNAi）を行った。Cecytb-5-2遺伝子をもとに合成したdsRNAをSoaking法により線虫体内に導入し、Cecytb-5-2遺伝子の発現をノックダウンした線虫と、通常の線虫の表現形を比較した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
資化性酵母を用いた異種発現系を構築することにより、線虫b561ホモログの１つを活性を持った状態で発現・部分精製することに成功している。さらに、in situ hybridizationと免疫染色法によりその発現部位の解析を行っている。また、未だ十分に成功しているとは言いがたいが、RNA干渉(RNA interference)によりその遺伝子のノックダウンの影響を解析している。これらの成果をもとにおおむね順調に研究が進展していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
RNA干渉(RNA interference)によりその遺伝子のノックダウの影響を解析しているが、ノックダウンの程度が不十分であり、より明確な結果を得ることの方策を吟味している。このb561ホモログ以外の線虫ホモログについても、同様な方策により研究を推進する予定である。
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