2013 Fiscal Year Research-status Report
シトクロムｂｄ型呼吸鎖末端酸化酵素の構造と環境応答の解明
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25440050
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 順司 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (80175364)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | シトクロム / 呼吸鎖 / アミノ酸生産菌 / 好熱性細菌 / グラム陽性菌 / 生体エネルギー変換 / 電子伝達系 / コリネバクテリアム |
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| Research Abstract |
アミノ酸生産菌Corynebacterium glutamicumにおいて、すでに作製した約10個のプロモーターに対してレポーターをつないだリコンビナント細胞について、測定に十分な蛍光強度を持つことを確認した上で、通気条件や炭素源・ビタミン等の豊富さ、呼吸酵素に使われるFeやCuを初めとする金属塩の濃度変化や添加への応答など多岐にわたる条件を調べた。増殖速度に比べて、呼吸鎖経路の転換がどれくらいの速度で起こるかも解明する方向で準備を進めている。
一方、好熱性バシラス属細菌のシトクロムbd型メナキノール酸化酵素について、培養条件のコントロールなどにより、発現量の増加を図った。これまで培養バッチごとに発現量が増減しやや不安定な場合があったが、減少傾向の察知される場合は培養温度をやや高め培養時間も延長することで増加に転ずる見込みが出た。精製条件についても、界面活性剤の種類やクロマトグラフィーの条件を変更することなどでさらなる改良を試みつつある。このうち界面活性剤は、現在主に用いているものから他の膜タンパク質の結晶化に有効だったものに置き換えてみたが、不純物の除去や比活性の向上にはつながらなかった。最後のカラム溶出時に置換するのが最適だと結論した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GFPを用いた分岐呼吸鎖酵素の使い分けのモニタリングの方は、実験はほぼ完成した。ただし投稿論文が容易には受理されなかったので、実験面と立論面の両方を検討しつつある。
一方、好熱菌シトクロムbd型酸化酵素の大量調製と結晶構造解析の方は、精製試料を定期的にドイツの研究協力者に送り続けている。空輸の条件制約ため精製試料を冷凍状態で送ることが不利の可能性もあるため、高発現膜画分の段階でも送付し、先方での精製 - 結晶化の試みも開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
GFPを用いた分岐呼吸鎖酵素の使い分けのモニタリングの研究は、最終段階としての投稿論文受理に精力を注ぐ。
一方、シトクロムbd型メナキノール酸化酵素の大量調製と結晶構造解析の方は、好熱菌についてはドイツとの研究協力を続ける。一方、冷凍空輸のデメリットの可能性を回避するため、同様のシトクロムbd型メナキノール酸化酵素を発現するアミノ酸生産菌について、冷蔵輸送の可能な国内の研究協力にも重点を置きたい。
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