2013 Fiscal Year Research-status Report
シス型プロリン残基をもつ分泌タンパク質の小胞体における品質管理
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25440060
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
小亀 浩市 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40270730)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質品質管理 / 小胞体 / プロリン異性化酵素 / ADAMTS13 |
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| Research Abstract |
タンパク質を構成するプロリン残基のシス-トランス異性化は、peptidyl-prolyl cis-trans isomerase（PPIase）という一群の酵素によって触媒される反応であり、タンパク質の立体構造形成（フォールディング）と機能発現にとって重要である。本研究では特に分泌タンパク質の品質管理におけるPPIaseの役割に着目し、シス型プロリン残基をもつ分泌タンパク質のフォールディング過程と、遺伝子変異等で生じる構造異常タンパク質の分解処理過程に関する解析を行っている。我々は最近、血中メタロプロテアーゼADAMTS13の基質認識を担うDTCSドメインの結晶構造を決定し、４個のシス型プロリン残基を同定した。そこで本年度は、シス型プロリン残基をもつ分泌タンパク質のモデルとして組換えADAMTS13-MDTCSドメイン（MDTCS）を利用し、そのフォールディングに対するPPIaseの関与を調べた。正常にフォールディングしたMDTCSの量は、細胞外に分泌されたMDTCS量の測定で見積もることができる。MDTCSを恒常的に発現するCHO細胞を、cyclophilin阻害剤であるシクロスポリンA存在下で培養し、培地に蓄積するMDTCS量を抗体およびADAMTS13特異的合成基質で定量した結果、シクロスポリンA用量依存的にMDTCSの分泌量が減少することが明らかになった。一方、FKBP（cyclophilin群と異なるPPIase群）阻害剤であるFK506の効果は弱かったため、MDTCSの分泌はPPIase群の中でもcyclophilin群に特異的であると考えられた。次に、小胞体PPIase B（cyclophilin B; CypB）の発現を抑制するsiRNAで同細胞を処理した結果、CypBの細胞内発現量の減少とともに、MDTCSの分泌量も減少した。一方、細胞質の代表的PPIaseであるCypAに対するsiRNA処理では、CypAの発現量は減少したものの、MDTCSの分泌量はほとんど影響を受けなかった。したがって、MDTCSの正常な分泌にはプロリン残基のシス化が必要であり、その反応は主にCypBが担うことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、分泌タンパク質であるADAMTS13の小胞体における正常なフォールディングにプロリン残基のシス-トランス異性化が重要であることを証明し、その異性化に関与する酵素を特定することを主な目的としていた。そのためにADAMTS13-MDTCSを発現する細胞を利用し、シクロスポリンやFK506等のPPIase選択的阻害剤、CypB発現を抑制するsiRNA等の効果を調べ、ADAMTS13の分泌にはプロリン残基のシス化が重要であることと、そのシス化反応にCypBが強く関与することを明らかにした。したがって、研究実施計画の立案時に想定していた最も重要なデータを得ることができたと言える。一方、CypBおよび不活性型CypB（R95A変異体）を過剰発現させる培養細胞実験系や、ADAMTS13変異体に対するCypBの関与を調べる実験については、さらなる追加解析が必要で、次年度以降にも継続する。また、CypBが小胞体関連分解（ERAD）で機能することを示す実験にも注力する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の計画立案当初は、初年度の研究実績をベースに論文を作成する予定であった。しかし、着想の相違はあったものの、米国の研究グループからきわめて類似した内容の論文[Hershko et al, JBC 287, 44361-44371 (2012)]が発表されたため、平成26年度以降のデータも含めた形での論文化を想定している。平成26年度にはマウス個体を用いた実験を開始する。まず、野生型マウスにシクロスポリンAを投与した後、あるいはCypBのsiRNAや発現ベクターを導入した後、血中ADAMTS13活性を測定し、CypB機能異常の影響を調べる。siRNAやDNAの導入には、すでに我々が成功実績をもつin vivoハイドロダイナミクス法を使用する。また、ADAMTS13変異体のERADによる分解を解析することで、個体レベルでCypBのERADに対する寄与を観察する。これにもハイドロダイナミクス法を使用する予定である。ADAMTS13以外の分泌タンパク質として、主に血液凝固関連タンパク質も分析対象としたい。平成27年度には、小胞体PPIaseの研究に適したモデル基質の開発を試みる。ADAMTS13およびその変異体を用いた研究成果と、これまでに報告されたフォールディングモデル基質およびERADモデル基質の知見をもとに、小胞体PPIase（主にCypB）の研究に適したモデル基質を考案したい。これを培養細胞あるいはマウスに発現させ、シクロスポリンやsiRNA、発現ベクター等の効果を観察することで、CypB等が働く分子機構を詳細に解析する。また、ADAMTS13-P618A多型（Pro-618はシス型）の謎の解明にも挑みたい。P618A多型保有者の血漿ADAMTS13活性は正常であるが、培養細胞でP618A変異体を発現させると分泌量が約20％に低下するという、矛盾する特徴がある。この原因を明らかにすることで、シス型プロリン残基に関する新たな知見が得られると考えている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度の研究実施計画は概ね予定通りに遂行できたが、物品購入による支出を予想以上に低く抑えることができた。それは、費用面での効率を積極的に考慮し、計画立案当初に予定していた試薬類やキット類、プラスチック製品類などといった消耗品の使用量を可能な限り減らして実験を行うことができたためである。次年度以降の実施計画に予定以上の費用がかかる可能性を考慮したことも一因である。一方、物品費以外の支出は予定額を大きく越えることはなかったため、本年度全体としての所要額は計画当初の予定額を下回り、その差額を次年度に使用することとした。
次年度の研究計画にはマウス個体を使用する実験が多く含まれており、その購入や飼育にかかる費用だけでなく、使用する薬剤等についても本年度以上の出費が予想される。したがって、今回生じた次年度使用額の多くは、実験に要する物品の購入に充当することを予定している。
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[Journal Article] Up-regulation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS), silent mating type information regulation 2 homologue 1 (SIRT1) and autophagy-related genes by repeated treatments with resveratrol in human umbilical vein endothelial cells2013
Author(s)
Yoshie Takizawa, Yukiko Kosuge, Hiroyo Awaji, Emi Tamura, Ayako Takai, Takaaki Yanai, Reiko Yamamoto, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, Rieko Nakata, and Hiroyasu Inoue
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Journal Title
Brit. J. Nutr.
Volume: 110
Pages: 2150-2155
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The Satb1 protein directs hematopoietic stem cell differentiation toward lymphoid lineages2013
Author(s)
Yusuke Satoh, Takafumi Yokota, Takao Sudo, Motonari Kondo, Anne Lai, Paul W. Kincade, Taku Kouro, Ryuji Iida, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, Yoko Habuchi, Keiko Matsui, Hirokazu Tanaka, Itaru Matsumura, Kenji Oritani, Terumi Kohwi-Shigematsu, and Yuzuru Kanakura
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Journal Title
Immunity
Volume: 38
Pages: 1105-1115
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Long term follow up of congenital thrombotic thrombocytopenic purpura (Upshaw-Schulman syndrome) on hemodialysis for 19 years: a case report2013
Author(s)
Koki Mise, Yoshifumi Ubara, Masanori Matsumoto, Keiichi Sumida, Rikako Hiramatsu, Eiko Hasegawa, Masayuki Yamanouchi, Noriko Hayami, Tatsuya Suwabe, Junichi Hoshino, Naoki Sawa, Kenichi Ohashi, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata, Yoshihiro Fujimura, and Kenmei Takaichi
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Journal Title
BMC Nephrol.
Volume: 14
Pages: 156
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] A long-term phenotype analysis of 51 patients with Upshaw–Schulman syndrome in Japan, with special references to pregnancy and renal failure that requires hemodialysis2013
Author(s)
Yoshihiro Fujimura, Yumi Yoshii, Masanori Matsumoto, Ayami Isonishi, Masaki Hayakawa, Yoko Yoshida, Hideo Yagi, Koichi Kokame, and Toshiyuki Miyata
Organizer
The 55th ASH Annual Meeting and Exposition
Place of Presentation
New Orleans, USA
Year and Date
20131207-20131210
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[Presentation] Quantitative PCR assay demonstrated exon deletions of ADAMTS13 in two unrelated patients with Upshaw-Schulman syndrome2013
Author(s)
Yuka Eura, Koichi Kokame, Toshiro Takafuta, Ryojiro Tanaka, Hikaru Kobayashi, Fumihiro Ishida, Shuichi Hisanaga, Masanori Matsumoto, Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata
Organizer
XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
Place of Presentation
Amsterdam, The Netherlands
Year and Date
20130629-20130704
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