2013 Fiscal Year Research-status Report
病原性細菌特異的ファージの宿主認識と収縮性ファージ尾繊維構成蛋白質の構造生物学
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25440066
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金丸 周司 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (50376951)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 結晶構造解析 / ファージ / 蛋白質複合体 / 宿主認識 / 分子内シャペロン |
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| Research Abstract |
1.T4ファージgp34C末端ドメインの結晶構造解析
申請時に得られていたgp34C末端ドメインの結晶の結晶化条件を検討し、回折データ収集可能な品質の結晶を得ることができた。この結晶を用いて、放射光施設で回折データを収集し、分子置換法により1.9Å分解能の結晶構造を得ることができた。その結果、配列からは不明であったファージ尾繊維蛋白質に共通の構造モチーフが存在することが分かった。
2.PP01ファージgp37, gp38複合体の発現系の構築
PP01ファージのgp37C末端断片, gp38, 尾繊維シャペロンgp57Aの3つの蛋白質を大腸菌で共発現する系を構築した。その結果、gp37C末端断片, gp38は共に可溶性画分に発現し、発現したgp37C末端断片はC末端から約120残基付近で、プロセシングを受けることが分かった。また、切り離されるC末端120残基はK1FファージendoNF蛋白質と同様のメカニズムで、分子内シャペロンとして働いていることが示唆された。
3.PP01ファージgp37, gp38複合体の精製・結晶化
上記、発現系を用いて大量発現したgp37C*-gp38複合体を精製し、各種クロマトグラフィーを用いて精製を行った。その結果、この複合体はgp37C*：gp38が3：1の化学量論をもつ(gp37C*)3-(gp38)1であることが分かった。精製した複合体の結晶化スクリーニングも行い、微小な結晶を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定していたT4ファージgp34C末端ドメインの結晶構造解析に成功し、1.9Å分解能の3量体の結晶構造を得ることができた。
PP01ファージ(gp37C*)3-(gp38)1複合体の大量発現系を作成し、精製標品を得ることに成功し多。この複合体の化学量論を決定し、結晶化を試み結晶化に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
T4ファージgp34については、その全長の構造解析に挑戦する。同時に、N末端側、中間部位のみでの発現系も試みる。
PP01ファージ(gp37C*)3-(gp38)1複合体の結晶構造解析を行う。予備的な回折実験より、分解能が悪いので結晶化条件をさらに検討する。また、得られた複合体の標的蛋白質である大腸菌OmpCとの相互作用解析やリガンド-受容体の共精製を試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初、老朽化が心配され購入予定であった当研究室所有のカラムクロマト装置を制御するPC である[AKTAexplorer10sシステムPC]が、いまのところ使用できる状態にあるため、購入を先送りにすることとした。
上記[AKTAexplorer10sシステムPC]が使用不能となった際に、本計画研究の遂行に滞りなきよう速やかに当該機器を購入する。
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[Journal Article] Crystal structure of Cex1p reveals the mechanism of tRNA trafficking between nucleus and cytoplasm.2013
Author(s)
Nozawa K, Ishitani R, Yoshihisa T, Sato M, Arisaka F, Kanamaru S, Dohmae N, Mangroo D, Senger B, Becker HD, Nureki O.
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Journal Title
Nucleic Acids Res.
Volume: 41
Pages: 3901-3914
DOI
Peer Reviewed
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