2013 Fiscal Year Research-status Report

抵抗性品種に加害性を示すツマグロヨコバイ“バイオタイプ”の適応機構の解明

Research Project

Project/Area Number	25450075
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	National Institute of Agrobiological Sciences
Principal Investigator	服部誠独立行政法人農業生物資源研究所, 加害・耐虫機構研究ユニット, 研究専門員 (60370673)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松本由記子独立行政法人農業生物資源研究所, 加害・耐虫機構研究ユニット, 研究員 (80414944)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	バイオタイプ / 抵抗性品種 / 唾液タンパク質
Research Abstract	目的：ツマグロヨコバイ抵抗性イネ品種に対して加害性を示すバイオタイプで生じている遺伝的変異を明らかにするため、イネからの吸汁達成の鍵を握る唾液タンパク質に焦点を絞って遺伝子配列を比較解析する。研究方法：(1)バイオタイプ間で遺伝的変異をもつ唾液タンパク質を探索するため、つくば個体群に由来する愛知80号（抵抗性遺伝子Grh3保有イネ）加害性および非加害性バイオタイプの唾液腺抽出物（♀5頭分）を2次元電気泳動で分離して、銀染色後にパターンを比較した。(2)ツマグロヨコバイが唾液として吐出していることを確認しているタンパク質のcDNA配列を、つくば個体群由来のGrh3加害、Grh7加害および無選抜系統間で比較した。(3)今後の解析に有用な材料を得るため、鹿児島個体群についてもGrh7加害性のバイオタイプを作出し、遺伝様式を確認した。すなわち、Grh7保有イネ加害性を非加害バイオタイプと交配して得たF1、F2およびB1F1（戻し交配）世代の孵化幼虫5-7頭をGrh7保有芽出しイネが入った試験管内に放飼し、6日後に生死を判定した。研究成果の概要：(1)Grh3加害性バイオタイプにおいて、シフトが見られた唾液腺タンパク質スポットが１つ見つかった。(2)6種類の唾液タンパク質で遺伝子変異を比較したところ、Grh3加害系統だけで2箇所、Grh7加害系統だけで1箇所で塩基が変異していることがわかった。(3)Grh7保有イネを用いて生存率を調べた結果、Grh7加害および非加害系統を交配して得たF1ではほぼ100%、F2では約75%、2組のB1F1でそれぞれ約100%、50%を示したことから、鹿児島個体群においてもつくば個体群同様、Grh7加害性は常染色体上の優性単一遺伝子に支配されていると結論した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 唾液腺タンパク質の2次元電気泳動により、Grh3加害性バイオタイプ（つくば個体群由来）でシフトが見られるタンパク質スポットを１つ見出した。虫が吐出した唾液タンパク質も同様に比較しようとしたが、解析に必要な量のタンパク質を得るのが難しかったことから、計画を1年前倒しして、同定済みの唾液タンパク質の遺伝子配列を比較解析した。その結果、唾液タンパク質のcDNA配列で、Grh3およびGrh7加害性バイオタイプ（つくば個体群由来）で特異的な変異が検出された。また、変異の普遍性をチェックするために有用な材料を得るため、鹿児島個体群からGrh7加害性バイオタイプを作出し、加害性が単一優性遺伝することを確認した。
Strategy for Future Research Activity	来年度は、Grh3加害性バイオタイプでシフトが見られたタンパク質を同定し、その遺伝子配列をバイオタイプ間で比較する。また、つくば系統由来の加害バイオタイプで見つかった変異箇所が抵抗性品種に対する加害性と連関しているか否かを調べるため、鹿児島個体群由来の加害性バイオタイプについても変異を解析するとともに、加害性・非加害性バイオタイプを交配して得たF2分離世代を用いて個体別に抵抗性品種に対する加害性と遺伝子変異を解析する。一方、Grh1,2の各々に加害性を示すバイオタイプについてもこれまで同定した9種類の唾液タンパク質のみならず対象範囲を拡大して特異的な変異箇所を探索する。そのために、唾液腺で発現するRNAseqデータベースを作成する一方、唾液吐き出し液を直接HPLC-MS/MS分析することにより解析対象となるタンパク質を拡大する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	当初の計画では、各バイオタイプの”唾液腺抽出液”だけでなく、”唾液吐き出し液”も2次元電気泳動で比較解析する予定であったが、想定以上に回収できる唾液タンパク質の量が少なく、限られた期間で結果を得るのは労力的に困難と判断して断念した。そのため、各レンジのpIストリップを駆使した2次元電気泳動の実験はほとんど実施せず、試薬類とともに賃金も発生しなかったことから、予算の予定使用額が減少した。次年度は、唾液タンパク質の遺伝子配列を比較することに注力すべく、唾液吐き出し液を直接HPLC-MS/MS分析して新たな唾液タンパク質を同定することにより、解析対象とする配列を拡大する予定であり、多検体サンプルの解析に必要な経費として予算を充当する。