2014 Fiscal Year Research-status Report
レチノイン酸産生能を有する腸型樹状細胞の機能制御に基づく粘膜免疫強化法の研究
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25450190
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
中妻 彩 徳島文理大学, 薬学部, 助教 (30446075)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ビタミンA / レチノイン酸 / 粘膜免疫 / 樹状細胞 / T細胞 / 免疫寛容 / アレルギー / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
レチナール脱水素酵素2（RALDH2）を発現する腸の樹状細胞（DC）は、ビタミンAからレチノイン酸を産生し、小腸指向性リンパ球やFoxp3+誘導型制御性T細胞の誘導を促進する。我々は、ビタミンA欠乏マウスでは、DCによる炎症性T細胞の誘導が亢進しており、経口免疫寛容が破綻することを見出した。そこで、ビタミンAはどのような作用機序で腸型DCの機能を制御し、アレルギー炎症の予防や治療効果を促進するのかを明らかにするため、昨年度は、Flt-3Lで骨髄から分化誘導したDC（BM-DC）を、GM-CSFとレチノイン酸受容体アゴニストAm80で処理後、E-cadherinで活性化することによって、免疫寛容誘導に寄与するRALDH2+腸型DCへと分化誘導する方法を確立した。本年度は、その分子メカニズムの解明を目指した。また、ビタミンA欠乏下の腸管粘膜で成熟・活性化したDCによって誘導された炎症性T細胞が、腸以外の組織で過剰な免疫応答を起こし、アレルギーの発症や増悪の一因となるか検証した。
1. E-cadherinはBM-DC上のintegrin α1β2（CD49a/CD29）との結合を介して、DCの活性化とRALDH2発現を増強することを見出した。また、このシグナル経路には、FAK/PI3K/Akt経路とMEK/ERKの活性化が関与していることが示唆された。
2. マウス直腸由来の上皮性腫瘍細胞株CMT93細胞を入手し、GM-CSF＋Am80処理後のBM-DCと共培養したが、DCの活性化とRALDH2発現の増強効果は認められなかった。
3. ビタミンA欠乏マウスに抗原を経口投与した後、同一抗原を免疫することで、経口抗原特異的炎症性T細胞の誘導や、IgG1抗体およびIgE抗体産生が顕著に亢進した結果、皮膚に即時型アレルギー反応が惹起されることが示唆された。また、ビタミンA欠乏マウスの腸間膜リンパ節由来DCで活性化した炎症性T細胞を、DNFBを抗原とした遅延型過敏反応を誘導したマウスに移入したところ、皮膚の炎症局所への有意な蓄積が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度に繰り越していた、腸上皮細胞株を利用した新規アッセイ系の構築に着手することはできたが、成功に至らず、引き続きアッセイ系の改善方法を模索する必要がある。しかし、ビタミンA欠乏マウスを用いたアレルギー炎症反応の惹起・増悪の検証は達成しており、本研究の達成目標全体を通して、おおむね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. これまでの成果より、腸上皮細胞が発現する代表的な接着分子の一つであるE-cadherinが、GM-CSF+Am80で誘導されたRALDH+CD103+ DCの活性化を促進し、小腸指向性Foxp3+誘導型制御性T細胞誘導能を賦与する可能性が示された。一方、E-cadherinと同じタイミングでToll様受容体（TLR）リガンドを作用させることによって、小腸指向性Th1/Th17誘導能を有するRALDH+CD103+ DCを誘導することにも成功した。当初の研究計画では予定していなかったが、我々が分化誘導系を構築したRALDH2+炎症抑制性DCあるいは炎症誘導性DCによって、マウス個体の中で炎症が制御できるかどうかを検証する。これらのDCをDSS誘導性大腸炎モデルマウスに移入し、症状の進行に与える影響を検証する。
2. 腸上皮細胞によるRALDH2+腸型DCの分化誘導への影響を検証するため、CMT93細胞との共培養系を確立する。ヒトの腸上皮細胞株Caco-2で一般的に利用されているカルチャーインサートを用いた単層培養を、CMT93細胞に応用する。この時、E-cadherinやintegirinに対するブロッキング抗体や、これらのシグナルに関わる因子の阻害剤などを添加し、その影響を解析する。得られたDCをナイーブT細胞と共培養し、T細胞の機能分化誘導能を検証する。T細胞の分化マーカーやケモカイン受容体発現、またはサイトカイン産生について解析する。
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| Causes of Carryover |
毎年、年度末に開催される日本薬学会の年会で研究発表を行うため、旅費を確保しておいたが、残金が生じたため次年度に回した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞調製に必要なMACSビーズ（1本当たり10万円前後）とMACSカラム（1セット約6万円）、ELISA、フローサイトメトリー、免疫染色、ブロッキング試験で必要な抗体や、real-time PCRに用いるRNA抽出試薬や酵素類など（1本当たり3～7万円前後）、さらに、細胞の調製や疾患モデルの作製に必須であるマウスの購入費および飼育費、細胞培養に必要な牛胎児血清、培地、サイトカインなどの細胞増殖・分化誘導因子などの試薬や、培養ディッシュ、ピペット、試験管などのプラスチック器具などが、本研究を通じて必須である。従って、次年度の物品費と合わせて、当該年度の未使用額はすべて物品費に充てる。
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