鶏の脳内摂食調節ペプチドは自発的飼料摂取量変動に関与しているか？

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25450391
• Research Institution: Utsunomiya University
• Principal Investigator: 菅原 邦生 宇都宮大学, 農学部, 教授 (50091947)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 祐介 宇都宮大学, 農学部, 助教 (50589520)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: NPY / GLP-1 / in vitro 回収率 / 自発的飼料摂取量

Outline of Annual Research Achievements

25年度から引き続き，NPYの定量法と透析サンプリングシステムの回収性能を向上させ，側脳室と視床下部腹内側核の両ペプチドの関係を明らかにすることを目指した．25年度の結果から透析液中の鶏NPY及びGLP-1を質量分析法で定量することを試みたが，夾雑物の影響を除去できず良好な結果を得られなかった．26年度になって市販の鶏NPY ELISAキット（検出限界8pg/ml）を入手できたので，これを用いてエイコム社ニューロペプタイドサンプリングシステムでin vitro回収率を測定した．透析プローブは細孔サイズ1000kDa，材質ポリエチレン膜，潅流液は0.15%BSAを含むリンゲル液，潅流速度を1μL/分，潅流60分ごとに液を回収，温度30から35℃，外液にはELISAキット標準液（0.5nM）を用いた．回収率は最大3％であった．同じ透析プローブと潅流条件で鶏側脳室から得た透析液をキットで測定したが，NPYを検出できなかった．また，reverse dialysis法で0.5nMNPYを鶏側脳室に投与して摂食行動に対する影響を調査したが，摂食行動の変化は観察できなかった．

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

従来用いてきた脳微小透析法と類似の手技であるペプチドダイアリシス法をこの研究に適用しているが，当初の想定を超えた困難さに遭遇している．in vitro回収率は10から15%を出せる予定であったが，現在は3から6％であり，この改善に手間取っている．

Strategy for Future Research Activity

NPYとGLP-1の測定を円滑に実施するために，研究分担者をこれまでに反芻動物のペプチドホルモンを時間分解蛍光分析法によって定量した経験を有する者に変更し、時間分解蛍光分析法を採用する．また、質量分析法もあわせて検討する．in vitro回収率を10から15%に向上をさせるために，エイコム社の技術者と協力して透析プローブの材質の変更，潅流速度の低減などを行なう．

Causes of Carryover

26年度前半に質量分析法によるペプチドの定量を試みたが，満足できる結果が得られなかったのでこの方法の適用を断念した結果，予定した経費を使用しなかった．また，in vitro回収率の向上を目指した実験では種々の改善法を試しながら進めたので，支出が予定を下回ったので次年度に繰り延べた．

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度はペプチドの定量に市販キット（in vitro回収率）、時間分解蛍光分析法（検出限界の拡大）および質量分析法を採用し，回収率向上のために透析プローブの材質や細孔サイズの変更に使用する予定である．