2013 Fiscal Year Research-status Report
難治性炎症性疾患に対するPKCetaを分子標的とした新規治療法
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25460153
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
大場 基 昭和大学, 腫瘍分子生物学研究所, 講師 (70297018)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 分子標的薬 / PKC / 炎症 |
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| Research Abstract |
本年度は、１）PKCetaを分子標的とした炎症性疾患の新規治療法の開発を目指し、PKCeta siRNAを各種の経皮吸収剤を用いて皮膚内に導入、その抗炎症効果を検証し、臨床応用の可能性を探った。ハプテン誘導性にアトピー性様皮疹を生じるマウス：NC/Ngaマウス皮膚に接触させ、その効果を、１）臨床的診断（掻痒行動、皮膚症状スコアリング：Leungのclinical skin condition scoreを使用）、２）免疫学的診断、３）病理学的診断から検討した。現在のところ、siRNAの皮膚内への吸収にはリン脂質をベースとしたエマルジョン基材が最も有効であり、一定の抗炎症効果を確認できた。更に、より高効率で安定的にsiRNAの導入を行うために、ポリアルギニンペプチド等、細胞透過性ペプチドを用いた方法に関しても予備検討を行った。
次に、ペプチド導入治療法の開発を目的として、PKCeta 偽基質ペプチド：TRKRQRAMRRRVHQVNGとその修飾体の培養細胞への導入を検討した。同ペプチドにポリアルギニン配列を付加した易細胞透過性ペプチドを合成、FAMで蛍光標識し、培養表皮ケラチノサイト細胞に導入、最適な修飾配列を検討した。８残基のアルギニンを付加することで、比較的高効率に導入可能であった。しかしながら、その活性阻害効果はmyristoylate修飾を施したPKCeta 偽基質ペプチドよりも１０倍以上低かった。その原因として、細胞内で同ペプチドがドット状に偏在していることが考えられた。今後、より最適なペプチド配列を見いだすことで、この問題を解決したいと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
siRNAを用いた遺伝子治療に関しては、概ね予想通りの進捗状況である。より高効率で安定性の高い方法を確立することが今後の課題であり、その目標を達成することで一層の進展が見込めると考えている。また、ペプチド導入による治療法は、その抑制効率等に不十分な点があり、ペプチド配列を含めた検討が必要である。また、今年度は培養ケラチノサイトへの導入にとどまっており、in vivoへの適応も検討課題である。
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| Strategy for Future Research Activity |
siRNAによる抗炎症治療の達成のために、siRNA自体の安定化とその導入効率の向上を目指す。今年度は非修飾siRNAを用いて全ての実験を行ったが、来年度はS化(ホスホロチオエート結合)siRNAや複数の企業より提供されている安定化修飾済みsiRNA(siSTABLE:Thermo Scientific社等）を利用し、より高い抗炎症効果を達成する。また、siRNAの皮膚内への導入方法として、非侵襲性と特異性、効率の面からより優れた基材が、近年、複数の企業・大学において開発・提案されている。これらの研究者と共同研究を行うことで、導入方法を確立し、PKCeta siRNAを用いた抗炎症核酸治療法の確率を行いたい。
ペプチド療法に関しては、その導入効率と抑制効果を上昇させるために、最適なPKCeta偽基質ペプチドに対する修飾配列を見いだす。
また、偽基質ペプチド以外の、より特異性の高いPKCeta阻害ペプチドの探索を行う。PKCには、各々の分子種に対応した活性調節蛋白質:RACK(receptor of activated C kinases)が存在する。現在、RACKとの相互作用阻害ペプチドを用いた、分子種特異的な活性抑制法の開発と癌を含む難治性疾患に対する臨床試験が米国を中心に行われている（例：ψεRACK (KAI-1455)）。しかしながら、PKCηに対するRACKは未だ同定されていない。そこで、免疫沈降法とLC-MS/MS解析を利用してPKCη特異的RACKを同定し、相互作用阻害ペプチドの開発につなげたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度中に、PKCηの活性化に係わる相互作用因子を同定するために、その免疫沈降産物を質量分析機を用いて解析する予定であった。しかしながら、高純度の精製サンプルを得ることが困難であり、その解析が26年度に延期されたため。
FLAGタグ配列付加ベクターとそのタグ抗体ビーズを用いることで、培養ケラチノサイトから高純度PKCηを得ることに成功している。次年度には、質量分析を行い、上記解析を行う予定である。
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