2013 Fiscal Year Research-status Report
眼疾患患者の眼房水中の微環境を推察するための診断法の開発
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25460238
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyushu University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
高村 徳人 九州保健福祉大学, 薬学部, 教授 (20369169)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
緒方 賢次 九州保健福祉大学, 薬学部, 講師 (90509580)
徳永 仁 九州保健福祉大学, 薬学部, 准教授 (60369171)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 眼房水中アルブミン / タンパク結合 |
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| Research Abstract |
本研究では、眼疾患患者の眼房水中の微環境を推察するための診断法の開発を目指している。しかしながら、一人の患者の眼房水の採取量は微量であり、眼房水中に含まれるアルブミンや点眼薬物の濃度も著しく低いため測定のハードルは高い。したがって、眼房水中アルブミンの結合サイトをモニターするプローブの濃度もかなり低く設定せねばならない。このような状況下、低濃度のアルブミン、対象点眼薬物のジクロフェナクおよび種々のサイトプローブの測定を検討してきた。その結果、アルブミンは尿中アルブミンを測定するキットを利用し生化学検査装置インテグラで測定可能とした。ジクロフェナクや種々のサイトプローブ（サイトIプローブとしてフェニルブタゾン、バルサルタン、ワルファリン、一方、サイトIIプローブとしてケトプロフェン、スプロフェン、ジアゼパム、フルルビプロフェン）に関しては微量試料からの定量であるため、同時定量出来るように高圧HPLCの条件を見出し測定するに至った。
これにより、個々の患者の眼房水を用いて、眼房水中アルブミン濃度と各種結合サイトの結合能の相関性を検証できる。さらに、微量定量の精度が高まれば多めに残った眼房水からアルブミン以外の蛋白種であるグロブリンおよび眼房水中に含まれる各種脂肪酸やアスコルビン酸などの物質が測定できれば、それらと各種結合サイトの結合能の相関性も検証できるため、眼房水中の微環境を的確に反映できる診断法を開発できる可能性が高まる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各種サイトプローブを用いた簡便な眼房水中診断法の開発の進展の内訳は以下の通りである。
１）アルブミン結合性の高い点眼薬、アルブミンの結合能を的確に判断できるサイトプローブおよび眼房水中組成の検索・選定については、点眼薬物としてジクロフェナク、サイトIプローブとしてフェニルブタゾン、バルサルタン、ワルファリン、一方、サイトIIプローブとしてケトプロフェン、スプロフェン、ジアゼパム、フルルビプロフェン、眼房水中の内因性物質としてグロブリン、各種脂肪酸およびアスコルビン酸などを見出した。
２）疑似眼房水（ここでは、実際の眼房水中アルブミン濃度と同程度のアルブミンをリン酸バッファーに溶かしたものを疑似眼房水という）中アルブミンに対する上記の薬物およびサイトプローブの結合性について検討した結果、評価可能な結合能を有することが判明した。高圧HPLCで迅速な微量同時定量法（微量の試料に含まれる複数のサイトプローブを高圧HPLCで一度に測定可能とする方法）を確立できた。限外濾過器はウルトラセント-10（東ソー社製）を使用することでジクロフェナクや各種サイトプローブの吸着は他の限外濾過器より低く抑えることができ、高圧HPLCによる移動相の基線にも乱れを生じさせないことが分かった。これにより、実際の眼房水を用いて、房水中アルブミンの結合サイトの結合能の程度を多角度から検証できる可能性が高い。
３）眼房水中アルブミンの低濃度の微量定量を尿中アルブミン用キットを利用し生化学検査装置で測定可能にした。これにより、実際の眼房水を用いて、房水中アルブミン濃度と各種結合サイトの結合能の相関性を検証できる。
したがって、平成25年度に引き続き平成26年度も順調に研究を遂行したい。
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| Strategy for Future Research Activity |
疑似眼房水中アルブミンに対する眼房水中診断法の精度の検討については以下の手順で進める予定である。
１）疑似眼房水中アルブミンへの各結合サイトにおける結合能の変動の検討。実験方法：眼疾患患者の眼房水にはグロブリン等のアルブミン以外のタンパク質が増加する場合があるとの報告がなされていることより、アルブミンに対するグロブリンの濃度比率を変えた種々の疑似眼房水を調製し、それに各結合サイトプローブを一定量添加し限外濾過法にて遊離濃度を測定し結合能を算出する。さらにその疑似眼房水に各種脂肪酸やアスコルビン酸などを添加し、その影響も各結合サイトプローブの結合能の変化により算出する。
２）1）より得られたデータを多角度から分析・評価し、眼房水中診断法の構築を試みる。実験方法：疑似眼房水中の各結合サイトプローブの遊離形濃度の大小の差異のデータとグロブリンやFFAやアスコルビン酸などの濃度を多角度的に比較し、グラフ化等も行い相関等を見出す。
３）疑似眼房水および患者プール眼房水に対する結合阻害薬物の検討。実験方法：各結合サイトプローブを一定量添加した疑似眼房水および患者プール眼房水に結合阻害薬物を濃度を変えて加え限外濾過法にて遊離濃度を測定し結合能の変化を調べる。
上記の結果は、実際の眼房水中アルブミンの結合サイトの結合能の大小はアルブミン以外のグロブリンなどの蛋白種による影響か各種脂肪酸やアスコルビン酸などの物質による影響かを推察できる診断法の構築に大きく寄与することとなる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
旅費が見積もりより安くなったため。
物品費に加算して使用する。
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