2013 Fiscal Year Research-status Report
多重プロモーターと選択的スプライシングによるエストロゲン受容体発現調節機構の解明
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25460319
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
石井 寛高 日本医科大学, 医学部, 講師 (20445810)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | エストロゲン受容体 / 多重プロモーター / 選択的スプライシング / 遺伝子発現制御 / エストロゲン / 生殖生理学 / 生殖機能形態学 / 神経内分泌学 |
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| Research Abstract |
ヒト・マウス・ラットEstrogen receptor β (ERβ)遺伝子の5’-非翻訳領域(5’-UTR)変異体をRapid amplification of cDNA 5’-end (5’-RACE)法を用いて同定し、それら配列をゲノム上にマッピングすることでERβ遺伝子の5’-領域の構造を解析した。解析の結果、ヒトERβ遺伝子の転写は0K、0N、E1プロモーターにより制御されており、プロモーターに対応したリーダーエクソンがエクソン1に存在する共通のスプライスアクセプター部位にスプライシングすることで5’-UTR変異体が生じることが判明した。さらに、ヒトERβ遺伝子の5’-領域には多数の非翻訳中間エクソンが存在しており、それらエクソンがエクソン0Kとエクソン1の間に挿入されることにより、多数の5’-UTR変異体が生じていた。さらにマウス・ラットERβ遺伝子との比較解析を行った結果、マウス・ラットERβ遺伝子ではヒトの0N、E1プロモーターと相同のプロモーターのみが存在し、5’-UTR変異体は限定的であった。
ERβ遺伝子はマウス・ラットでは前立腺や卵巣に高発現をするが、ヒトでは精巣で高発現する。選択的プロモーターの使用と選択的スプライシングパターンを解析した結果、ヒトでは３つのプロモーターすべてが精巣で強い活性を示していた。さらに0Kプロモーターは特に精巣と脳で使用されており、非翻訳中間エクソンの挿入パターンが精巣と脳で異なることも明らかとなった。
ヒトERβ mRNAにはスタートコドン上流にin frameストップコドンが存在し、多様な5’-UTR変異体が存在しても翻訳されるタンパク質構造は同一である。そのため、ヒトERβ mRNAの多様な5’-UTR変異体は転写後調節を介してERβ遺伝子の発現を制御している可能性がある。この可能性を検証するため、ヒトERβ遺伝子の5’-UTR変異体の5’-UTRを組込んだレポーターベクターを作成し、ヒトERβ遺伝子の転写後調節制御を評価する系を立ち上げている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はヒト・マウス・ラットERβ遺伝子の5’-UTR変異体を5’-RACE法で解析し、同定した配列をゲノム上にマッピングすることでERβ遺伝子の5’-領域の構造を決定・比較を行った。この解析は計画通り順調に進行し、ヒト・マウス・ラットERβ遺伝子の5’-領域の構造解析は終了した。
選択的プロモーターの使用と本研究で新規に同定した非翻訳中間エクソンの挿入により、ヒトERβ遺伝子から数多くの5’-UTR変異体が生じることが判明した。現在、ヒトERβ 5’-UTR変異体の生理学的意義を同定するため、ヒトERβ遺伝子の5’-UTR変異体の5’-UTRを組込んだルシフェラーゼレポーターベクターを作成中である。当初の計画では平成25年度中にレポーターベクターを用いて5’-UTR変異体の転写後調節機構への関与について解析を開始するはずであったが、予想以上に多数の5’-UTR変異体が同定されたため、レポーターベクターの作成が平成26年度にずれ込んでいる。
その一方でレポーターベクターの作成と並行して平成26年度に実施する予定であったヒトERβ遺伝子の多重プロモーター使用パターンと選択的スプライシングパターンの解析を前倒しして行い、それらパターンをRT-PCR法を用いて同定した。マウス・ラットERβ遺伝子に関しては一部のERβ高発現臓器において多重プロモーター使用パターンと選択的スプライシングパターンの解析を行ったが、幅広い臓器における解析は当初の予定通り平成26年度に実施する。
以上より、平成25年度の本研究は、多少の遅れや実験計画の前倒しがあるものの研究実施計画通りにほぼ順調に推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在作成を行っているヒトERβ遺伝子の5’-UTR変異体の5’-UTRを組込んだルシフェラーゼレポーターベクターを用いてヒトERβ 5’-UTR変異体の生理学的意義を同定する。レポーターベクターを動物細胞に導入し、ルシフェラーゼアッセイと定量的PCR法を組み合わせて転写後調節機構、特に翻訳効率とmRNA安定性について解析を行う。多数の5’-UTR変異体が同定されたため平成26年度にレポーターベクターの作成がずれこんではいるが、作成自体は順調に進んでおり、平成26年度中にヒトERβ mRNAの5’-UTRが転写後調節に与える影響の解析が開始出来る。
ヒトERβ遺伝子の多重プロモーター使用パターンと選択的スプライシングパターンの解析は平成25年度に前倒しして行い同定済みである。マウス・ラットにおいてはERβ遺伝子の高発現部位で解析を行ってはいるが幅広い臓器・組織では未実施のため、マウス・ラットERβ遺伝子のそれらパターンの詳細を解析する。
Estrogen receptor α (ERα)遺伝子の多重プロモーター使用パターンと選択的スプライシングパターンはマウス・ラットではすでに解析済みであるが、ヒトERα遺伝子では一部のプロモーターや限局した臓器のみでしか解析を行っていないため、ヒトERα遺伝子に含まれるすべての選択的プロモーターを対象にして幅広い臓器での解析を予定している。
さらに、ERα・ERβ遺伝子の選択的プロモーターとそれらに付随する発現調節領域を組込んだルシフェラーゼレポーターベクターを作成し、それらレポーターベクターを用いてERα・ERβ遺伝子の転写調節機構を解析する。さらに、ERα・ERβ遺伝子の発現制御にかかわるシス・トランス調節因子の同定と種間での比較を行う予定である。
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