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2013 Fiscal Year Research-status Report

SAM合成酵素を標的とするエピゲノム書き換え法

Research Project

Project/Area Number 25460351
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionTohoku University

Principal Investigator

加藤 恭丈  東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 講師 (40397914)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Keywordsエピジェネティクス / SAM合成酵素 / コンディショナルノックダウン / ヒストンメチル化 / DNAメチル化
Research Abstract

メチオニン・アデノシル転移酵素II(MATII)は、触媒サブユニット(α)と機能不明な非触媒サブユニット(β)から構成され、S-アデノシルメチオニン(SAM)の生合成を触媒する。合成されたSAMはメチル基転移酵素(MT)の基質として利用され、そのメチル基はDNA中のシトシンやヒストンのリジン残基などへ転移され、クロマチンレベルでのエピジェネティクスを支配する。本研究の主題は、ヒストンやDNAのメチル化を包括的に低下させる方法を開拓し、細胞記憶を消去し、クロマチンと細胞の可塑性を高める技術を開拓することである。平成25年度では、siRNAによる一過性のMATIIαノックダウンに加え、薬物誘導によりshRNAを発現させる「コンディショナルノックダウン」のES 細胞を作製することを試みた。この細胞から、ヒストンやDNAのメチル化を検出し、遺伝子発現プロファイリングまでの研究遂行を目指した。まず、MATIIαのshRNAを構築して、マウス肝癌細胞株(Hepa1)に遺伝子導入して、一過性のノックダウンを確認した。また、この細胞株を用いて全タンパク質抽出を行い、ナノ液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計(LC-MS)による発現タンパク質の同定と定量の測定を行った(プロテオミクス解析)。この解析から、タンパク質同定数が約4000種程度になったことから、コントロール細胞と比較して、MATIIαノックダウンによって発現量の変動したタンパク質を同定した。一方で、構築できたMATIIαのshRNAは、ES細胞に遺伝子導入しているところである。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

おおむね予定通りに研究が遂行できている。まず、MATIIαのsiRNAが成功しているので、その標的配列を利用することができ、効率良く個構築することができた。一方で、MATIIαノックダウンによるタンパク質発現のプロファイリングは、最新の質量分析システムを利用したことで、予想以上の成果が得られた。このことから、遺伝子発現プロファイリングの解釈が容易になり、MATIIによる包括的なエピゲノム制御の意義も見いだし易くなった。

Strategy for Future Research Activity

今後は、SAMを産生するMATIIαのノックダウンES細胞をいよいよ構築して、そのヒストンやDNAのメチル化状態を調べる。特に、質量分析装置を最大に活かして、ヒストンH1バリアントを区別して、そのメチル化の変動を捉えたり、DNAマイクロアレイ解析から、遺伝子発現プロファイリングを完成さたりして、MATIIによる包括的なエピゲノム制御機構を解明していきたい。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

ES細胞へのノックダウン構築に必要な遺伝子導入可能な細胞株を、海外から入手する費用を繰り越したことと、当初、予定していた遺伝子発現プロファイリング解析に必要とした諸費用もタンパク質レベルの解析で、年度を越してしまうことが分かったためであり、残りの解析(DNAマイクロアレイ)に必要とする諸費用は、次年度へ繰越しとする。
実験計画に基づいて、ES細胞株の入手および、DNAマイクロアレイ解析もおこなう。それぞれに当初から予定していた諸費用を、繰り越した費用から捻出する。

  • Research Products

    (5 results)

All 2013

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] Methionine adenosyltransferase II-dependent histone H3K9 methylation at the COX-2 gene locus.2013

    • Author(s)
      Kera Y, Katoh Y, Ohta M, Matsumoto M, Takano-Yamamoto T, Igarashi K.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 288 Pages: 13592-13601

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.429738.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Solution structure of clostridial collagenase h and its calcium-dependent global conformation change.2013

    • Author(s)
      Ohbayashi N, Matsumoto T, Shima H, Goto M, Watanabe K, Yamano A, Katoh Y, Igarashi K, Yamagata Y, Murayama K.
    • Journal Title

      Biophys J.

      Volume: 104 Pages: 1538-1545

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2013.02.022.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] メチオニンアデノシル転移酵素(MATII)の細胞内局在2013

    • Author(s)
      石山駿、加藤恭丈、森野杏子、槙野絵里子、五十嵐和彦
    • Organizer
      第36回分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] メチオニンアデノシル転移酵素の細胞内局在と制御機構2013

    • Author(s)
      加藤恭丈、森野杏子、石山駿、齋藤維友、槙野絵里子、島弘季、五十嵐和彦
    • Organizer
      第7回日本エピジェネティクス研究会年会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂
    • Year and Date
      20130530-20130531
  • [Presentation] メチオニンアデノシル転移酵素(MATII)によるエピジェネティックなCOX-2遺伝子発現制御機構2013

    • Author(s)
      解良洋平、加藤恭丈、太田嶺人、松本光代、山本ー高野照子、五十嵐和彦
    • Organizer
      第7回日本エピジェネティクス研究会年会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂
    • Year and Date
      20130530-20130531

URL: 

Published: 2015-05-28  

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