2014 Fiscal Year Research-status Report
先天性トキソプラズマ症に対するex vivoパルス自己樹状細胞ワクチンの導入
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25460512
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
青才 文江 信州大学, 医学部, 委嘱講師 (80150316)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 先天性トキソプラズマ症 / トキソプラズマHSP70 / 樹状細胞(DC)ワクチン / 細胞傷害性T細胞 (CTL) / T細胞ペピチドエピトープ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１、 末梢の未熟DCを標的としたトキソプラズマ タキゾイト特異的HSP70 (T. gondii HSP70) 遺伝子ワクチンにより、所属リンパ節へのDCの遊走・分化・成熟が誘導され、成熟DCのIL-12産生増加によってTh1型免疫応答が惹起され、抗トキソプラズマ防御免疫が成立する。
２、 DC標的T. gondii HSP70遺伝子ワクチンにより、CD8+およびCD4+細胞傷害性T細胞 (CTL) が共に誘導され、T. gondii HSP70遺伝子ワクチンが誘導するCD8+CTL およびCD4+ CTLは、T. gondii HSP70蛋白パルスsyngeneic (H-2b) DC細胞株 (DC2.4) やT. gondii HSP70遺伝子導入DC2.4 (DC2.4-T. gondii HSP70) を標的とした特異的細胞傷害活性のみならず、トキソプラズマ感染DC2.4に対しても特異的細胞傷害活性を示す。
３、 本ワクチンが誘導するCD8+ T細胞およびCD4+ T細胞はIFN-gamma産生と感染細胞特異的CTLの両者により、IFN-gamma依存性・非依存性にトキソプラズマ感染に対する防御免疫を担っている。
４、 CD8+ あるいは CD4+ T細胞の移入感染実験により、感染急性期、および、慢性期に明らかな感染防御免疫が誘導される。
５、 ex vivo 成熟DCワクチン確立に向けT. gondii HSP70のT細胞ペピチドエピトープ解析をすすめ、標的DCが発現するMHCクラスＩ分子（感染感受性マウスのH-2Kb/Db分子およびヒトHLA-A2分子）に結合する9-merペピチドエピトープの候補ペプチドを選択した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は、当初計画通り、DCワクチンによるＴ細胞性防御免疫誘導について以下の解析を行った。
1、 T. gondii HSP70遺伝子導入in vivo DCワクチンによるCTL誘導とCTLエピトープの解析：DC標的in vivo T. gondii.HSP70遺伝子ワクチンを接種したマウスの脾臓細胞中に、T. gondii HSP70蛋白パルスDC株 (DC2.4) やT. gondii HSP70遺伝子発現DC2.4 (DC2.4-T. gondii HSP70) のみならず、トキソプラズマ感染DC2.4に特異的細胞傷害活性を示すCTLが誘導され、かつ、CTL はCD8+およびCD4+CTLの両者が誘導され、これらの移入感染実験により感染防御免疫が誘導されることを明らかにした。 また、これらのCD8+/CD4+CTLの細胞傷害機構を解析し報告した。
2、 T. gondii HSP70のT細胞ペピチドエピトープ解析について、標的DCが発現するMHCクラスＩ分子（感染感受性マウスのH-2Kb/Db分子およびヒトHLA-A2分子）に結合する 9-mer ペピチドエピトープを、SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/) やBIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/mobio/hla￢_bind/) などのMHC結合性ペプチド予測プログラムを用いて選択し、さらに、NetMHCpan (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/) により affinityを予測することにより、候補ペプチドの絞り込みを終えた。次年度、T. gondii HSP70のペプチド合成によるCTLエピトープ解析を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1、 感染細胞特異的CTLが認識するMHC分子結合T. gondii HSP70エピトープの解析：感染感受性C57BL/6マウス(H-2b)とヒトのMHC分子(HLA)に結合するT. gondii HSP70の当該ペプチドを複数合成し、ペプチドパルスDC2.4（C57BL/6マウス由来DC株）を標的細胞に用いたCTL assay によりkeyとなるCTLエピトープを明らかにする。
2、 ex vivo T. gondii HSP70 DCワクチンによる妊婦のＴ細胞性防御免疫誘導の解析: (1) 非感染妊娠マウスをコントロールとして、妊娠感染マウスの胎盤と脾臓におけるCTL誘導を、非感染およびトキソプラズマ感染DC2.4、DC2.4-T. gondii HSP 70、および、T. gondii HSP70 T細胞ペプチドエピトープをパルスしたDC2.4を標的細胞に用いて解析する。(2) ex vivo T. gondii HSP70 DCワクチンによる妊娠マウス胎盤および脾臓、および、新生児マウス脾臓におけるCTL誘導を解析する。具体的には、i) 妊婦または新生児マウスの末梢血中の未熟DCをT. gondii HSP70蛋白パルスにより成熟させ、ii) 得た成熟DCにMHC分子結合T. gondii HSP70 CTLペピチドエピトープをパルスし、iii) その戻し移入によりiv vivo T細胞性防御免疫の効率的誘導を図り、iv) 妊娠マウス胎盤および脾臓、および、新生児マウス脾臓におけるCTL誘導を解析する。次に、v) ex vivo成熟CTLエピトープパルスDCワクチンにより誘導される防御免疫能を多角的に解析する。
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| Causes of Carryover |
平成26年４月より研究代表者の本研究基点が信州大学に移行し実験準備に多少の時間を要した。しかし、平成26年度内に、MHC結合性ペプチド予測プログラムを用いてCTLエピトープとなる候補ペプチドの選択は終えており、次年度に、T. gondii HSP70のペプチド合成によるCTLエピトープ解析のための使用額を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
感染細胞特異的CD8+CTLが認識するMHCクラスＩ分子結合する9-mer T. gondii HSP70ペプチドエピトープ、および、CD4+ CTLが認識するMHCクラスⅡ分子結合13-15mer T. gondii HSP70ペプチドエピトープを、各々数種類合成し、それぞれのペプチドパルスDC2.4を標的細胞とするCTL assayにより鍵となるCTLエピトープを決定する。
MHC分子結合CTLペプチドエピトープの合成に、ペプチド1本(5mg)あたり、9残基で56,000円、15残基で74,000円(5mg/本)を必要とする。
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