2014 Fiscal Year Research-status Report
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25460533
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
菅井 基行 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 教授 (10201568)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久恒 順三 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 助教 (40513180)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | アトピー性皮膚炎 / 黄色ブドウ球菌 / フィラグリン / 比較ゲノム / 菌固着 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度の研究実績として、①皮膚環境に対する適応性の解析-「蛍光発色AD由来株にける病理学的解析」について、これまでにAD由来株で蛍光発色の良い菌株が得られていなかったので、GFPプラスミド発現させるプロモーターとしてsarA P1 promoter、そして、sod遺伝子のRBS配列に置き換えることで、強い蛍光発色するAD由来株を得ることができた。一方、AD由来TF3378の遺伝子欠損株を作成については、従来法での遺伝子改変が困難であった為、新たな遺伝子改変法の確立を目指して、作製した黄色ブドウ球菌用CRISPR/Cas9プラスミドを検証した。その結果、黄色ブドウ球菌では非相同性末端修復系を欠く為に、修復による変異導入効率が極端に低いことが判明した。並行して、mRNAをターゲットに発現を抑制するCRISPRi用プラスミドを作製し、検証したところ、効率良く目的タンパクの発現をオフにできることがわかった。このうち、CRISPRiによりTF3378株のバイオフィルム形成に関わる遺伝子のノックダウン株を作製に成功した。②皮膚への固着性に関わる因子の探索-「AD由来株の完全ゲノム配列決定」について、AD由来株TF3378のドラフト配列、そして、600bp長ライブラリをイルミナMiSeqで読んだリードを足して、参照ゲノムMW2株にマッピングし、残りのgap箇所をサンガー法による繋ぎ、最終的に完全配列を取得することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の実施計画①皮膚環境に対する適応性の解析において、黄色ブドウ球菌のアトピー性皮膚炎からの由来株では、遺伝子改変が困難であった為、従来法では作製できず、方法の変更を余儀なくされた。そこで、新しいゲノム編集ツールの一つであるCRISPR/Cas9システムを黄色ブドウ球菌用に応用する為にプラスミドの開発を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の推進方策として、CRISPRiで作製したAD由来TF3378のPIAノックダウン株を用いて、付着・固着に関与するか否かを評価する。また、蛍光タンパク発現TF3378株について、マウス皮膚感染実験により菌の詳細な局在解析を行い、FKG-KOマウスに感染させて本株の適応性を比較解析する。
AD由来株の完全ゲノム配列を取得したので、他の由来株のと比較解析によりAD由来株の特徴、あるいは、アトピー皮膚環境における代謝経路を比較解析する。
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| Causes of Carryover |
AD由来TF3378株の従来の遺伝子組み換え法では作製困難で、新たな遺伝子改変技術導入を余儀なくされ、予定していた作製法変更のために生じたためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
生じた次年度使用額について、作製株の検定PCRの際に、用いる試薬の使用額として用いることとする。
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[Journal Article] Application of moisturizer to neonates prevents development of atopic dermatitis.2014
Author(s)
Horimukai K, Morita K, Narita M, Kondo M, Kitazawa H, Nozaki M, Shigematsu Y, Yoshida K, Niizeki H, Motomura K, Sago H, Takimoto T, Inoue E, Kamemura N, Kido H, Hisatsune J, Sugai M, Murota H, Katayama I, Sasaki T, Amagai M, Morita H, Matsuda A, Matsumoto K, Saito H, Ohya Y.
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Journal Title
The Journal of allergy and clinical immunology.
Volume: 134
Pages: 824-830
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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