2013 Fiscal Year Research-status Report
グラム陽性病原細菌のプロテインキナーゼを介するシグナル伝達の解明
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25460535
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
成谷 宏文 香川大学, 医学部, 助教 (30452668)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉井 栄治 松山大学, 薬学部, 准教授 (40333512)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Clostridium perfringens / ガス壊疽菌 / シグナル伝達 / プロテインキナーゼ / プロテインホスファターゼ / 非メバロン酸経路 / タンパク質相互作用 / Yeast Two-Hybrid Screen |
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| Research Abstract |
グラム陽性病原細菌に普遍的に存在する真核型Protein Ser/Thr Kinase (K) - Phosphatase (P)を介するシグナル伝達系の機能をClostridium perfringens (ガス壊疽菌)をモデルとして解明する。
我々は既に、K-Pが基質膜タンパク質(S)のThr-92のリン酸化調節により、同菌の生育・形態を制御していること、基質膜タンパク質はClostridium属に特異的に存在し、タンパク質相互作用領域を有する新規シグナル伝達因子であり、新規抗菌薬のTargetとして注目されている菌特異的な必須代謝経路（非メバロン酸経路）の酵素IspGとの相互作用を見いだしている。本研究では、基質膜タンパク質とIspGの分子・生理機能を解析し、K-Pシグナル伝達系の全貌を明らかにし、同属菌に起因する感染症治療に向けた分子微生物学的知見を得ることを目的とする。本年度は、以下について検討を行った。
1) IspGの細胞内局在性、Sの膜トポロジーの解析 2) IspGの各変異株における発現解析、菌の生育・形態形成へ影響の検討 3) S の新規相互作用因子の探索 4） Kのシグナル分子の同定
GFP融合S の細胞内局在性解析から、S は隔壁、両極に局在する。IspGは、細胞内タンパク質と思われるが、その局在性については不明である。Sは構造上Bi-topologicalと推定されるが、両末端HAタグ S発現株のプロトプラストを用いた蛍光免疫染色を行い、S の膜トポロジーを決定した。また、S のPhosphorylation Mimics（Thr-92-Glu）: S (T92E) を作製し、発現解析を行った。更に各変異株でのIspG発現解析を行った。Kのシグナル分子として細胞壁分解物が推定されるため、細胞壁のEndolysin (Psm)分解物の調製を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Sの膜トポロジーの解析のため、N末端HAタグSをXylose 誘導発現ベクターpXCにクローンした。S欠損株の相補は成功したが、C末端HAタグSと比べ、ガス壊疽菌での発現量が極めて低く、その改良を検討した。RNA二次構造予測により、SのN末端４残基(MSKY)を Translation Enhancing Element (TEE) として付加する事で、 その発現量が大幅に改善した。これらの発現株のプロトプラストをPsmで調製し、間接免疫蛍光染色法により解析した。その結果、Sは、N-in/C-outの膜タンパクである事が示唆された。S (T92E) の発現解析を行った結果、S(T92A)同様、Kによるリン酸化は認められなかったが、S(T92A)とは異なり、非リン酸化S様の機能相補は認められなかった。IspG遺伝子は、必須遺伝子である。IspG遺伝子をXylose 誘導発現ベクターにクローニングし、ガス壊疽菌の親株に形質転換し、C末端タグ付き／無しのIspGを発現させ、タグ抗体で検出し確認した。いずれの発現株においても、IspG発現により、菌の形態が伸長した。現在、S変異株等での発現解析を検討している。
S の新規相互作用因子の探索として、HisタグSによるFormaldehyde Cross-Linking (FACL)、Pull-Down (PD)解析を行った。しかし、FACLではPsmによる溶菌／可溶化が困難であり、プロトプラストでのFACLでも同様であった。PDでは、HisタグSの発現及び非発現株の菌体をHisタグなしPsmで処理し(0.5 % CHAPS存在下)、菌体ライセートを調製、Ni-IMACにより分画した。SDS-PAGE後、発現株分画に特異的なバンドについてN末端アミノ酸配列の決定を行った。現在のところ、有力な相互作用因子はまだ特定されていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、YFP融合IspG遺伝子を作製し、IspGの局在性を解析する。更に、GFP融合Sとの共発現株を用いたFRET解析を検討する。ガス壊疽菌より単離した細胞壁を、Psmを含めた酵素的に異なる複数のEndolysinで分解物し、HPLCによる分画の検討している。現在、別のタイプのEndolysinを同定、精製し解析を行っている（分担：玉井栄治／松山大学）。調製次第、添加実験を行い菌の形態とSのリン酸化レベルを解析する。
S (T92E) およびS (T92A)、更にIspGの全体および各機能性領域 (N末端、C末端4Fe–4S cluster領域)に分割しYeast Two-Hybrid Screenを行い、Sとの相互作用領域の特定と他の相互作用因子の探索を行う。Cross-linkingは、Formaldehyde ではなくPhoto-Met/Leuを使用する予定である。PDについても更に条件検討を行っている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品等の使用が多少、少なかった。
消耗品等の購入に充てる。
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[Presentation] Determination of binding site for Clostridium perfringens on fibronectin2013
Author(s)
Seiichi Katayama, Mika Tagomori, Hatsuo Yamashita, Tsutomu Yamasaki, Hirofumi Nariya, Mariko Okada, Mariko Watanabe, and Yasuo Hitsumoto
Organizer
8th International Conference on the Molecular Biology and Pathogenesis of the Clostridia 2013
Place of Presentation
Sea Temple Resort & Spa Palm Cove, Palm Cove, Queensland, Australia
Year and Date
20131022-20131026
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