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2013 Fiscal Year Research-status Report

E型肝炎ウイルス感染性クローンを用いた増殖機構および病原性の解析

Research Project

Project/Area Number 25460580
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionNational Institute of Infectious Diseases

Principal Investigator

石井 孝司  国立感染症研究所, 国立感染症研究所, 室長 (40280763)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 李 天成  国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (90370957)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
KeywordsE型肝炎ウイルス / 複製機構 / 感染メカニズム / 病原性
Research Abstract

近年、HEVを培養細胞系で増殖させる系が確立されたが、ウイルスの増殖は非常に遅く、ウイルスの病原性やトロピズムを解明する上で、効率のよいHEVの増殖系を確立することが望まれている。本年度は、感染性のHEV cDNAクローンからのレプリコンの構築を試みた。また構築されたレプリコンをHEV VLPに包埋させた、一過性の感染性粒子を取得することができるかどうかについて検討を行った。
感染性のHEVクローン83-2の構造蛋白領域をレポーター遺伝子で置換したcDNAを作成し、本クローンの上流に挿入したT7 promoterを用いてRNAを作成した。本RNAをヒト肝癌由来細胞PLC/PRF/5細胞にエレクトロポレーションにより導入し、レポーター遺伝子が機能するかどうか調べた。また、本細胞で構造蛋白を発現させ、さらにレプリコンRNAを導入することで、構造蛋白中にレプリコンRNAが包埋された形で粒子構造が形成されるかどうかを調べた。
感染性クローン83-2の構造蛋白であるORF2領域をレポーター遺伝子と置き換えることによりHEVレプリコンを構築した。構造蛋白(ORF2)を発現する細胞に、IRES-GFPNeoを持つレプリコンを導入した細胞を作成した。その中には構造蛋白の分泌が比較的良好なクローンがあった。これらのクローンの培養上清を濃縮しショ糖遠心密度勾配で分析したところ、構造蛋白は一定の密度に収束し、粒子構造をとっている可能性が示唆された。上記のフラクションをRNase A処理後にRNAを抽出し、構造、非構造それぞれの領域のRT-PCRを行ったところ、本フラクションのRNAはRNase A抵抗性であり、構造領域のみがPCRで増幅されたことから、レプリコンが包埋された粒子である可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

HEVのレプリコンの構築に成功した。また、PLC/PRF/5細胞に構造遺伝子発現プラスミドとレプリコンRNAを導入し、培養上清を濃縮しショ糖遠心密度勾配で分析したところ、構造蛋白は一定の密度に収束し、粒子構造をとっている可能性が示唆された。上記のフラクションをRNase A処理後にRNAを抽出し、構造、非構造それぞれの領域のRT-PCRを行ったところ、本フラクションのRNAはRNase A抵抗性であり、構造領域のみがPCRで増幅されたことから、repliconが包埋された粒子 (trans-packaging particles) である可能性が示唆された。また、レプリコン導入細胞を用いたレプリコン複製阻害化合物のスクリーニングの系を確立し、低分子薬剤のライブラリーからの阻害化合物のスクリーニングを開始している。LOPAC化合物ライブラリーから、HEVレプリコン複製阻害活性を持つ化合物をピックアップしたところ、すでにHEV増殖阻害活性が報告されていたリバビリンが含まれており、本スクリーニング系の妥当性が示されたのではないかと思われる。阻害活性を持つ低分子化合物の阻害メカニズムの解析は、HEVの病原性発現メカニズムの解析に役立つと思われる。

Strategy for Future Research Activity

今後、上記のレプリコンが包埋された可能性のある画分について、電子顕微鏡での観察と感染性の有無の確認を行う予定である。感染性が確認できれば、本粒子はトランスパッケージ型の1回のみ感染性の粒子として、HEVの感染過程の解析に有用であると考えられる。また、HEVの中空粒子はカルシウム濃度を調節することにより、中空粒子の分解と再構成を行うことができる。この原理を利用し、外部からHEVレプリコンRNAを添加してVLP中に包埋させる手法も検討する。
HEVはgenotypeにより感染性が異なり、genotype 1、2はヒトのみに感染するが3、4はヒト以外にもブタ、イノシシなどにも感染する。この感染性の差が生じるメカニズムについても、複製をレプリコンで調べ、細胞への吸着、侵入をVLPを使って検討することで、感染性の差がどの段階で生じているのかを明らかにしたい。
また、HEVレプリコン複製阻害化合物のウイルス複製抑制効果を調べ、急性E型肝炎治療薬としての可能性を検討する。また、これらの複製抑制および促進活性を有する化合物を利用し、HEVの感染、増殖機構や病原性発現メカニズムの解析も行う予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

論文の英文校正のための研究費だが、年度内に論文が完成しなかったため。
新年度に英文校正費として使用する。

  • Research Products

    (12 results)

All 2014 2013

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 1 results) Presentation (8 results)

  • [Journal Article] Molecular detection of hepatitis E virus in rivers in the Philippines.2014

    • Author(s)
      Li T.C., Yang, T., Shiota T., Yoshizaki S., Yoshida H., Saito M., Imagawa T., Malbas F., Lupisan S., Oshitani H., Wakita T. and Ishii K.
    • Journal Title

      American Journal of Tropical Medicine and Hygine

      Volume: 90 Pages: 764-766

    • DOI

      10.4269/ajtmh.13-0562

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Chronic Hepatitis B Prevalence among Children and Mothers: Results from a Nationwide, Population-Based Survey in Lao People’s Democratic Republic.2014

    • Author(s)
      Xeuatvongsa A., Komada K., Kitamura T., Vongphrachanh P., Pathammavong C., Phounphenghak K., Sisouk T., Phonekeo D., Sengkeopaseuth B., Som-Oulay V., Ishii K., Wakita T., Sugiyama M. and Hachiya M.
    • Journal Title

      PLOS One

      Volume: 9 Pages: e88829

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0088829

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Neutralizing antibodies induced by cell culture-derived hepatitis C virus was effective both in vitro and in vivo.2013

    • Author(s)
      Akazawa D., Moriyama M., Yokokawa H., Omi N., Watanabe N., Date T., Morikawa K., Aizaki H., Ishii K., Kato T., Mochizuki H., Nakamura N. and Wakita T.
    • Journal Title

      Gastroenterology

      Volume: 145 Pages: 447-455

    • DOI

      10.1053/j.gastro.2013.05.007

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Hepatitis E virus capsid C-terminal region is essential for the viral life-cycle: Implication in viral genome encapsidation and particle stabilization.2013

    • Author(s)
      Shiota T., Li T.C., Yoshizaki S., Kato T., Wakita T. and Ishii K.
    • Journal Title

      Journal of Virology

      Volume: 87 Pages: 6031-6036

    • DOI

      10.1128/JVI.00444-13

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Epidemiological and genetic analysis of hepatitis A in Japan.2014

    • Author(s)
      Ishii K., Kiyohara T., Yoshizaki S., Tada T., Shimada T., Nakashima K., Noda M., Wakita T.
    • Organizer
      18th International Picornavirus Symposium
    • Place of Presentation
      Blankenberge, Belgium
    • Year and Date
      20140309-20140314
  • [Presentation] ワクシニアウイルスDIs株を母体としたインフルエンザHA組換えワクチンの混合接種によるカニクイザルでの発症予防効果2013

    • Author(s)
      宗片圭祐、安井文彦、伊藤 靖、石井孝司、七戸新太郎、喜田 宏、小笠原一誠、小原道法
    • Organizer
      第17回日本ワクチン学会
    • Place of Presentation
      津
    • Year and Date
      20131130-20131201
  • [Presentation] A型肝炎のリスクアセスメント2013

    • Author(s)
      清原知子、石井孝司、多田有希、脇田隆字
    • Organizer
      第17回日本ワクチン学会
    • Place of Presentation
      津
    • Year and Date
      20131130-20131201
  • [Presentation] E型肝炎ウイルス感染性規定宿主因子の探索に関する研究2013

    • Author(s)
      塩田智之、李 天成、吉崎佐矢香、西村順裕、清水博之、下島昌幸、西條政幸、脇田隆字、石井孝司
    • Organizer
      第61回日本ウイルス学会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131110-20131112
  • [Presentation] E型肝炎ウイルスレプリコンの構築とレプリコン包埋VLP作成の検討2013

    • Author(s)
      石井孝司、李 天成、吉崎佐矢香、塩田智之、脇田隆字
    • Organizer
      第61回日本ウイルス学会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131110-20131112
  • [Presentation] 結晶構造解析とQM/MM計算の組み合わせによるノロウイルスとルイス抗原の結合解析2013

    • Author(s)
      白土東子、石田豊和、熊谷安希子、伊藤浩美、古川早苗、染谷雄一、石井孝司、脇田隆字、成松 久、久保田智己
    • Organizer
      第61回日本ウイルス学会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131110-20131112
  • [Presentation] 小児におけるHBs抗原保有率調査2013

    • Author(s)
      清原知子、石井孝司、杉山真也、溝上雅史、脇田隆字
    • Organizer
      第61回日本ウイルス学会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131110-20131112
  • [Presentation] Induction of neutralizing antibodies by vaccination with cell culture derived hepatitis C virus particles in primate model.2013

    • Author(s)
      Yokokawa H., Moriyama M., Nakamura N., Higashino A., Akari H., Kato T., Ishii K. and Wakita T.
    • Organizer
      20th International Meeting on HCV and Related Viruses
    • Place of Presentation
      Melbourne, Australia
    • Year and Date
      20131010-20131014

URL: 

Published: 2015-05-28  

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