虚血性心疾患治療を目指した心臓における細胞極性を制御するメカニズムの解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461119
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 中野 敦 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究開発基盤センター, 室長 (90648106)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北風 政史 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究開発基盤センター, 部長 (20294069)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 循環器・高血圧 / 細胞極性 / 分子生物学

Outline of Annual Research Achievements

低酸素や低血糖などの細胞ストレス状態によって細胞内AMP濃度は上昇するが，これを検知して活性化されるリン酸化酵素AMPKが，微小管の伸長端に結合して微小管伸長調節を司っているタンパク質CLIP-170をリン酸化し，培養細胞の極性や遊走を維持していることを我々は特定してきた。本研究では，上記メカニズムが培養細胞のみならず生体内でも認められるか否かについて，その分子機構とともに解明することを目的とする。心筋梗塞や心筋虚血の病変部では，低酸素状態による心筋細胞傷害によって一時的に極性を失った残存心筋細胞の再構築（再極性化）が起こることが知られており，今回は心臓をモデルとして研究を行う。生体内での観察には，拍動心臓を直視下にて観察でき，遺伝子操作技術が確立されつつあり，モデル動物の中でも成育が早いゼブラフィッシュを使用して，以下の項目について検討する。
１．ゼブラフィッシュの心臓におけるAMPKとCLIP-170分子の発現を確認するために，AMPKとCLIP-170の遺伝子発現状態を検討する。
２．AMPKによるCLIP-170のリン酸化の役割を明らかにするために，リン酸化を受けないCLIP-170をゼブラフィッシュの心臓にのみ発現させて心臓の形態変化を検討する。
３．マウスにおける現在までの検討では，全身のAMPKの発現を完全に抑制すると出生前の胎生期に死亡することがわかっている。そこで，受精後すぐに生きたまま観察が可能なゼブラフィッシュの遺伝子の働きを完全に抑制する方法を確立して，心臓におけるAMPKの発現を抑制することで，現在までマウスにて観察できなかった心臓の形態変化や機能を検討する。
これらの研究を通して，低酸素状態を含めた細胞ストレスに対する心筋細胞極性に関わる応答反応のメカニズムを解明し，虚血性心疾患治療の基盤となることを目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

AMPKによってリン酸化を受けないCLIP-170変異体を培養細胞に発現させると、微小管の伸長が阻害されて細胞極性が傷害される。そこで、ゼブラフィッシュの稚魚から採取したRNAを用いて作成したDNAライブラリーから、CLIP-170のcDNAを単離してAMPKによるリン酸化部位であるセリン311をアラニンに置換したリン酸化を受けないCLIP-170変異体を作成した。これを、ゼブラフィッシュの心臓特異的に発現させるために，酵母転写調節因子Gal4と、Gal4の認識配列であるUAS（upstream activator sequence）を用いた発現システムを利用して，変異CLIP-170を心臓特異的に発現させ，変異のないCLIP-170が発現している個体と比較して，変異CLIP-170が発現している個体にて心臓のループ形成異常が有意に多く認められた。しかしながら，ゼブラフィッシュにおけるGal4-UASを使用した系では，発現されているGal4がどのプロモーターによって制御されているかが不明であること，そのことによって真に心臓特異的に発現しているとは言えないことからAMPKの発現を抑制させる系の確立を行った。遺伝子改変技術としてTALEN（Transcription activator-like effector nuclease）とCRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins）を使用して解析中である。

Strategy for Future Research Activity

個体中の前細胞にてAMPKの発現を抑制する系にて，個体特に心臓の表現系の解析を行う。また，表現系が十分に現れないもしくは心臓に対する全身細胞の影響が大きい場合には，心臓特異的にAMPKの発現を抑制する系の確立を目指す。

Causes of Carryover

計画していた実験内容を変更したために予定していた予算が未執行となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

最終年度の本年度には予定予算を執行予定である。

Research Products

• [Journal Article] Augmented AMPK activity 1 inhibits cell migration by phosphorylating the novel substrate Pdlim5 (2015)
  • Author(s): Yan Y, Tsukamoto O, Nakano A, Kato H, Kioka H, Ito N, Higo S, Yamazaki S, Shintani Y, Matsuoka K, Liao Y, Asanuma H, Asakura M, Takafuji K, Minamino T, Asano Y, Kitakaze M, Takashima S
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 6 Pages: 0-0
  • DOI: 10.1038/ncomms7137
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Higd1a is a positive regulator of Cytochrome c Oxidase (2015)
  • Author(s): Hayashi T, Asano Y, Shintani Y, Aoyama H, Kioka H, Tsukamoto O, Hikita M, Shinzawa-Itoh K, Takafuji K, Higo S, Kato H, Yamazaki S, Matsuoka K, Nakano A, Asanuma H, Asakura M, Minamino T, Goto Y, Ogura T, Kitakaze M, Komuro I, Sakata Y, Tsukihara T, Yoshikawa S, Takashima S
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 112 Pages: 1553-1558
  • DOI: 10.1073/pnas.1419767112
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Plk1 phosphorylates CLIP-170 and regulates its binding to microtubules for chromosome alignment (2014)
  • Author(s): Kakeno M, Matsuzawa K, Matsui T, Akita H, Sugiyama I, Ishidate F, Nakano A, Takashima S, Goto H, Inagaki M, Kaibuchi K, Watanabe T
  • Journal Title: Cell Struct Funct Volume: 39 Pages: 45-59
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation (2014)
  • Author(s): Kioka H, Kato H, Fujikawa M, Tsukamoto O, Suzuki T, Imamura H, Nakano A, Higo S, Yamazaki S, Matsuzaki T, Takafuji K, Asanuma H, Asakura M, Minamino T, Shintani Y, Yoshida M, Noji H, Kitakaze M, Komuro I, Asano Y, Takashima S
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 111 Pages: 273-278
  • DOI: 10.1073/pnas.1318547111
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Phosphorylation of CLIP-170 by AMPK plays a crucial role for the speed of microtubule polymerization and directional cell migration (2014)
  • Author(s): Atsushi Nakano, Seiji Takashima, Naoki Mochizuki, Masafumi Kitakaze
  • Organizer: Federation of American Societies for Experimental Biology Science Research Conference, AMPK: Biological Action and Therapeutic Perspectives
  • Place of Presentation: Barga, Lucca, Italy
  • Year and Date: 2014-09-28 – 2014-10-03