2013 Fiscal Year Research-status Report
下垂体で機能する甲状腺ホルモントランスポーターの同定と機能解析
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25461547
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
難波 範行 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (10379076)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 甲状腺ホルモントランスポーター / 下垂体 / 下垂体前葉 / TSH産生細胞 |
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| Research Abstract |
甲状腺ホルモン（TH）トランスポーター mct8 欠損マウスでは、視床下部の甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）は過剰発現しており、THを大量投与しなければ抑制されない。一方、MCT8 異常症患児に 生理量の TH を投与すると 甲状腺刺激ホルモン（TSH）値は低下する。したがって下垂体では生理量の TH による negative feedback が機能していると考えられる。しかし、下垂体のTHトランスポーターの詳細は未だに不明である。そこで本研究では、下垂体において negative feedback を担うTHトランスポーターの同定を目指す。
1) 下垂体前葉におけるTHトランスポーター発現の網羅的検討
C57BL/6 マウス下垂体前葉より cDNA を作成し、RT-PCR 法で既知のTHトランスポーターを網羅的にスクリーニングした。検出したTHトランスポーター、mct8, lat1, lat2, oatp1a1, oatp1a4, oatp2b1, oatp3a1, oatp4a1 を定量的 RT-PCR 法により定量したところ、mRNAの発現量は 1.0:66.6:74.9:2.0:1.4:1.7:22.5:3.5 であった。
引き続き、マウス下垂体前葉の凍結組織切片を用い、in situ hybridization 法で lat1, oatp3a1 の発現を検討したところ、いずれも発現が確認された。
2) マウス下垂体由来 TSH 産生細胞におけるTHトランスポーターの発現解析
Dr. Pamela. L. Mellon, University of California, San Diego より供与された下垂体 TSH 産生細胞不死化株 TαT1 を培養し、実験条件の最適化を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス下垂体前葉組織におけるTHトランスポーター mRNA 発現の網羅的解析は順調に進めることができた。しかしながら、同定したTHトランスポーターの下垂体前葉組織内における局在、およびTSH産生細胞における局在を示すための実験が手技的に難しく、予定通りに進められていない。すなわち、lat1, oatp3a1 が下垂体前葉の TSH産生細胞に発現していることを証明するため、in situ hybridization法施行後に抗TSH抗体（Dr. A. F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, NIDDK より供与）との二重染色を行うと、洗浄過程が多くなりすぎ、組織片がスライドグラスからはがれ落ちてしまい、現在までに良好な染色標本が得られていない。
実験としては、抗lat1抗体、あるいは抗oatp3a1抗体と、抗TSH抗体との二重免疫染色が理想的と考えられるが、実用に耐えうる抗lat1抗体、抗oatp3a1抗体は存在しない。そこで、現行の 1) in situ hybridization 法を行った後、抗TSH抗体で免疫染色する方法のさらなる最適化、および 2) 連続切片を用いて in situ hybridization 法、抗TSH抗体による免疫染色を行う方法を平行して試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述したように、下垂体前葉のTSH産生細胞においてTHトランスポーターの発現および局在を証明することが、本研究を進める上で最重要である。したがって、現行の 1) 1枚のマウス下垂体前葉の凍結組織切片スライドにおいて in situ hybridization 法を行った後、抗TSH抗体で免疫染色する方法のさらなる最適化、2) 2枚の連続切片スライドを用いて in situ hybridization 法、抗TSH抗体による免疫染色を別々に行う方法を平行して試みている。ただし、2) の方法では両者の共局在の証明がやや難しくなる。
このステップで確定的なデータが得られてはじめて、次のステップである機能解析実験を行うだけの意義が出てくると考えられるため、引き続き実験を重ねている。
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[Presentation] A case of MCT8 deficiency with a novel mutation in the SLC16A2 gene2013
Author(s)
Ono E, Ariga M, Oshima S, Hayakawa M, Imai M, Ochiai Y, Matsushima S, Miyata I, Namba N, Ozono K, Ida H
Organizer
9th Joint Meeting of Paediatric Endocrinology
Place of Presentation
MiCo, Milan, Italy
Year and Date
20130919-20130922
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[Presentation] A novel MCT8 mutation in a Japanese patient with Allan-Herndon-Dudley Syndrome2013
Author(s)
Dateki S, Haraguchi K, Sato T, Nakatomi A, Fujiwara M, Sakurai M, Namba N, Ozono K, Moriuchi H
Organizer
9th Joint Meeting of Paediatric Endocrinology
Place of Presentation
MiCo, Milan, Italy
Year and Date
20130919-20130922
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[Presentation] Endocrinological investigations in two cases of MCT8 abnormality with novel mutations in the SLC16A2 gene2013
Author(s)
Ono E, Ariga M, Oshima S, Hayakawa M, Imai M, Ochiai Y, Matsushima S, Miyata I, Namba N, Ozono K, Ida H
Organizer
The Endocrine Society's 95th Annual Meeting & Expo
Place of Presentation
Moscone Center, San Francisco, CA, USA
Year and Date
20130615-20130618
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