2013 Fiscal Year Research-status Report
WT1蛋白を標的とするナノ粒子を用いた白血病の高感度MRD診断法の確立
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25461601
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
岡本 康裕 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (30398002)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 嘉文 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20260680)
隅田 泰生 鹿児島大学, 理工学研究科, 教授 (70179282)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | WT1 / 細胞死 / ペプチド / ナノ粒子 / MRD |
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| Research Abstract |
ALL細胞株(CCRF-CEM)を培養し、抗がん剤であるシタラビンを4mg/mLの濃度で添加し、細胞死を惹起した。PI (propidium iodide)用いてFACSを行い、45±6％の細胞が細胞死をおこしていることを確認した。（この条件は後の実験の陽性コントロールとする。）
上記の条件でシタラビンを添加し培養した培養液の上清を用いて、WT1抗体(C-19: Santa Cruz Bio)を用いてWestern blotを実施した。WT1蛋白は低レベルであったが、検出できた。
同条件で得られた培養上清を用いて、WT1蛋白をCBB染色し、この膜を用いてプロテアーゼを用いたin gel digestionし、ペプチドに断片化た。逆相HPLCにてペプチドの断片を得たのち、ペプチドマップを作成し、最終的にC-19抗体に結合した蛋白の内部配列を特定した。このアミノ酸配列を元に、3種類の25～30塩基のペプチドを合成した。
これらの合成ペプチドを用いて、合成ペプチドに特異的に結合する糖鎖をスクリーニングする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞死によって得られるWT1蛋白からペプチドの合成まではできた。また、WT1に対するELISAの方法も確立しているので、おおむね順調に進展していると判断した。
合成ペプチドに対する特異的な糖鎖のスクリーニングと、ナノ粒子の作成はまだ達成できていないが、技術的には大きな問題はないと予測てしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
合成ペプチドのいずれかに特異的に結合する糖鎖をスクリーニングする。糖鎖のスクリーニングには、糖鎖を固定化したバイオデバイスである「シュガーチップ」を用いる。次に、この糖鎖と金粒子を結合させ、WT1特異的ナノ粒子（ナノ粒子）を完成させる。
CCRF-CEMの培養液にシタラビンを添加し、細胞死を惹起した細胞培養液上清を、陽性コントロールとして用いる。陽性コントロールをナノ粒子を混合し、遠心し、ナノ粒子に結合したWT1蛋白を濃縮する。この濃縮された検体を用いて、ELISAを行い、WT1蛋白濃度を決定する方法を確立する。さらに、様々な割合の生細胞と死細胞を含む陽性コントロール検体の系列を作成して、これを用いて、ナノMRD法で測定し、ナノMRD法の検出感度を決定する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
初年度にペプチドの合成まで進展した。次の段階として、金粒子を用いて特異的なナノ粒子を作成する。粒子や反応液、細胞株などが必要であるが、ストックできない物品の購入を年度末に行うのをさけたために、次年度使用額が生じた。
初年度の計画で完遂できなかったナノ粒子の作成を、新年度からとぎれなく行う。ナノ粒子作成以降は、計画通り研究を進めるので、予定通りの使用額となる。
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[Journal Article] Assessment of Corticosteroid-induced Osteonecrosis in Children Undergoing Chemotherapy for Acute Lymphoblastic Leukemia: A Report From the Japanese Childhood Cancer and Leukemia Study Group.2014
Author(s)
Hyakuna N, Shimomura Y, Watanabe A, Taga T, Kikuta A, Matsushita T, Kogawa K, Kawakami C, Horikoshi Y, Iwai T, Okamoto Y, Tsurusawa M, Asami K
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Journal Title
J Pediatr Hematol Oncol
Volume: 36
Pages: 22-29
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Ramsay Hunt Syndrome in a Girl With Acute Lymphoblastic Leukemia During Maintenance Therapy.2013
Author(s)
Kodama Y, Okamoto Y, Nishi J, Hashiguchi S, Yamaki Y, Kurauchi K, Tanabe T, Shinkoda Y, Nishikawa T, Suda Y, Kawano Y
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Journal Title
J Pediatr Hematol Oncol
Volume: 35
Pages: 224-225
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Allogeneic stem cell transplantation for children with acquired severe aplastic anaemia: a retrospective study by the Viva-Asia Blood and Marrow Transplantation Group.2013
Author(s)
Chen J, Lee V, Luo CJ, Kwok A, Chiang S, Hongeng S, Tan PL, Tan AM, Sanpakit K, Li CF, Lee AC, Chua HC, Okamoto Y
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Journal Title
Br J Heamatol
Volume: 162
Pages: 383-391
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Comparison of intravenous with oral busulfan in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with myeloablative conditioning regimens for pediatric acute leukemia.2013
Author(s)
Kato M, Takahashi Y, Tomizawa D, Okamoto Y, Inagaki J, Koh K, Ogawa A, Okada K, Cho Y, Takita J, Goto H, Sakamaki H, Yabe H, Kawa K, Suzuki R, Kudo K, Kato K.
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Journal Title
Biol Blood Marrow Transplant
Volume: 12
Pages: 1690-1694
DOI
Peer Reviewed
