脳梗塞急性期におけるアクアポリン４/TRPV4 複合体を標的とした治療法の開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462221
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 山田 猛 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 共同研究員 (50230462)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 省二 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 共同研究員 (00570772) ; 河野 祐治 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 共同研究員 (20333479) ; 吉良 潤一 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40183305) ; 古田 興之介 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 共同研究員 (60546571) ; 松瀬 大 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70596395)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ＴＲＰＶ４ / ノックアウトマウス / 急性期脳梗塞

Research Abstract

１）TRPV4ノックアウトマウスの動物実験計画および遺伝子組み換え実験の計画書を九州大学の倫理委員会に提出し承認待ちの状態。
２）マウスの脳梗塞モデルの作成
20-25gの♂マウスを対象として、2%イソフルレンで吸入麻酔後、まずマウスを腹臥位として頭部の皮膚を切開、剥離し頭蓋骨を露出。レーザードップラー血流計(FLO-C1、OMEGAWAVE社製)の血流測定用プローブを右中大脳動脈(MCA)支配領域に接着剤にて固定する。マウスを仰臥位として、前頸部を正中切開し、頸動脈を露出する。まず右総頸動脈を一時的に閉鎖、次に右外頸動脈(ECA)を結紮の上切開し、silicon coated monofilaments (602056PK10、栓子径200μm、全長20mm、Doccol社製) を挿入。右内頸動脈の末梢側へと進めることで、右MCAの閉塞を行う。MCAの閉塞はレーザードップラー血流計での血流信号の低下によって確認する。確認後は頭部のプローブを除去し、皮膚をナイロン糸で閉創する。前頸部を同様にナイロン糸にていったん閉創してゲージに戻す。MCA閉塞から2時間後に再度麻酔し、前頸部を抜糸して開創。ECA断端より挿入したfilamentを除去して閉塞を解除することで急性期脳梗塞（MCA 2時間閉塞）モデルを作成する。カテーテル抜去後のECA断端は結紮し、右総頸動脈の一時閉鎖を解除。再び前頸部をナイロン糸にて閉創する。
３）脳梗塞モデルの評価系の確立
梗塞巣の評価には、2,3,5-triphenyltetrazolium chloreide (TTC)染色を用いる。脳梗塞作成から24時間後にイソフルレン吸入にて十分に深麻酔をかけたのちに頸椎脱臼させ安楽死させ、脳を摘出する。マウス用のブレインスライサにて1mm間隔の冠状断の脳切片を作成し、1% TTC溶液中に37℃、20分間静置する。染色された脳標本をデジタルカメラにて撮影し、画像処理ソフトウエアを用いて梗塞体積を評価する。今後は免疫学的な評価のため、灌流固定後に凍結切片の作成を予定している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスの脳梗塞モデルの作成及び評価方法は確立した。

Strategy for Future Research Activity

TRPV4ノックアウトマウスの動物実験計画および遺伝子組み換え実験の承認後、TRPV4ノックアウトマウスでの脳梗塞実験を行う。その後、薬剤介入を加える実験に進めていく。