2013 Fiscal Year Research-status Report
新規ジペプチジルペプチダーゼ酵素群の発現と細胞内分布の解析
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25462894
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
根本 優子 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10164667)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根本 孝幸 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90164665)
木村 重信 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (10177917)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ジペプチジルペプチダーゼ / 歯周病原性細菌 / 酵素 |
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| Research Abstract |
我々が発見した新規ジペプチジルペプチダーゼ(DPP)11を中心として，歯周病原性細菌であるPorphyromonas gingivalisの病原性に関与するジペプチド分解系の解明を目指し，DPP11およびその他DPP酵素群の発現と細胞内分布について検討した。P. gingivalis ATCC 33277株の培養は既報に基づき1ug/ml menadion添加培地，嫌気条件で培養し，ゲノムDNAを精製した。各DPP遺伝子を含む発現ベクターを作成し，Escherichia coli XL1-Blue株に導入後，IPTG誘導によりリコンビナント体を発現精製した。酵素活性は各種ジペプチド-MCA蛍光基質で測定した。また，耐性遺伝子を含むDNA断片をPCR等によって作成し，得られたDNA断片を相同組換えによって親株に導入し，種々のDPP遺伝子破壊株を作成した。野生株，単一DPP欠損株，及び多重DPP欠損株の増殖能について検討した結果，多重DPP欠損株での顕著な増殖遅延が観察された。DPPの細胞内局在は，菌体外画分，外膜，ペリプラズム，内膜，及び細胞質をそれぞれ細胞分画法とショ糖密度勾配遠心で調製し，画分画についてDPP酵素活性と免疫ブロット法検討したところ，DPPは主にペリプラズム画分に局在することを見出し報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
既知の3種類のDPPの欠損株や複数種類のDPP欠損株の作成に成功した。これらの菌株を用いた検討から，これまではAspergillus fumigatus等の病原性及び非病原性真菌でのみ報告のあったDPP5が原核生物であるP. gingivalisで発現し，機能していることを発見した。P. gingivalis DPP5の発見により，DPP5遺伝子は真性細菌，古細菌，および高等動植物まで広く分布していることが明らかとなった。DPP5はN末端から2番目のAla及び疎水性アミノ酸と3番目のアミノ酸の間のペプチド結合を特異的に加水分解すること，また，P. gingivalisでは他のDPPと同様に主にペリプラズムに局在し，2量体で存在することを見出し報告した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討から，P. gingivalisでは4種類のDPPが主にペリプラズムに局在するものと考えられた。一方，インクレチン代謝に関与するDPP4は，ヒト細胞では細胞膜結合型と遊離型の両者があり，いずれも2量体で存在することが知られている。DPPの局在と2量体化の分子メカニズムについて，P. gingivalis ATCC 33277から作成した種々の遺伝子破壊株，及び，種々のP. gingivalis菌株を用いて検討する。各々のDPP遺伝子の発現については，当初計画に従い定量的PCRにより検討する。また, DPP酵素群の病原性についての検討を開始する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
測定精度をあげる目的でHPLCの設置を済ませたが，追加の必要関連機器，消耗品の購入にあてるために次年度に繰り越した。
HPLC用カラム，及び関連消耗品，修理費等にあてる予定である。
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[Journal Article] Identification and characterization of prokaryotic dipeptidyl-peptidase 5 from Porphyromonas gingivalis.2014
Author(s)
Ohara-Nemoto, Y., Rouf, S.M.A., Naito, M., Yanase, A., Tetsuo, F., Ono, T., Kobayakawa, T., Shimoyama, Y., Kimura, S., Nakayama, K., Saiki, K., Konishi, K., and Nemoto, T.K.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 289
Pages: 5436-5448
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] In vitro processing of glutamyl endopeptidase proenzymes from Enterococcus faecalis and importance of N-terminal residue in enzyme catalysis.2013
Author(s)
Rouf, S.M.A., Ohara-Nemoto, Y., Ono, T., Shimoyama, Y., Kimura, S., Nemoto, T.K.
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Journal Title
Advances in Biochemistry
Volume: 1
Pages: 73-80
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Phenylalanine 664 of dipeptidyl peptidase (DPP) 7 and phenylalanine 671 of DPP11 mediate preference for P2-position hydrophobic residues of a substrate.2013
Author(s)
Rouf, S.M.A., Ohara-Nemoto, Y., Ono, T., Shimoyama, Y., Kimura, S., Nemoto, T.K.
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Journal Title
FEBS Open Bio.
Volume: 3
Pages: 177-183
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Measurement of protease activity of exfoliative toxin A using synthetic peptidyl substrates and correlation between in vivo and in vitro activities.2013
Author(s)
Tachi, M. T., Ohara-Nemoto, Y., Baba, T.T., Kobayakawa, T., Fujita, S., Ikeda, T., Ayuse, T., Oi, K., Nemoto, T.K.
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Journal Title
Acta Med. Nagasaki.
Volume: 58
Pages: 41-48
Peer Reviewed
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[Presentation] Dipeptide production in Porphyromonas gingivalis mediated by dipeptidyl peptidases and gingipains.2013
Author(s)
Ohara-Nemoto, Y., Abdur-Rouf, S. M., Shimoyama, Y., Kimura, S., and Nemoto, T. K.
Organizer
113rd General meeting of ASM
Place of Presentation
The Colorado Convention Center (Denver, USA)
Year and Date
20130518-20130521
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[Presentation] Distribution of Porphyromonas gingivalis fimA genotypes in the children’s plaques.2013
Author(s)
Shioyama, Y., Ohara-Nemoto, Y., Kimura, M., Sasaki, M., Tanaka, M., and Kimura, S.
Organizer
113rd General meeting of ASM
Place of Presentation
The Colorado Convention Center (Denver, USA)
Year and Date
20130518-20130521
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