2014 Fiscal Year Research-status Report
口腔癌細胞のマウス同所移植モデルにおける腫瘍リンパ管新生と前転移ニッチ形成
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25462935
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (70350139)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 和也 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (70549055) [Withdrawn]
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
島津 徳人 麻布大学, 生命・環境科学部, 准教授 (10297947)
青葉 孝昭 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (30028807)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 腫瘍 / 扁平上皮癌 / 癌微小環境 / 血管新生 / リンパ管新生 / リンパ節転移 / 遺伝子発現 / 同所移植モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、癌細胞の増殖・浸潤・転移などの悪性形質に影響を与える“癌微小環境”として癌実質―間質要素間の相互作用が注目されている。本研究では、口腔癌の早期リンパ節転移メカニズムの解明を長期目標として、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株のヌードマウス同所移植モデルを用いて、癌細胞による脈管新生誘導と脈管侵襲・リンパ節転移の促進に働く癌細胞―間質間相互作用の解明を目指す。
前年度（初年度）においては、癌細胞株を移植したマウス個体でのリンパ節転移巣形成率を指標として、ヒトリンパ節転移病巣由来株OSC19, HSC2, OSC20では形成率100%（高転移性）、原発巣由来株KOSC2, HO-1u1では50%未満（低転移性）を区別した。また、マウス担癌舌組織の最大組織割面（直径2 mm超の腫瘍胞巣）に相当するパラフィン包埋試料から薄切切片を作成し、サイトケラチン（CK）・E-カドヘリン・CD44等の癌形質マーカーとPECAM/Lyve1等の血管・リンパ管内皮マーカーの多重免疫染色を施して癌形質変化の観察および脈管間質の定量解析を実施した。成果として、癌環境における脈管間質形成パターンと癌細胞形質との関連を評価し、特に高転移性株の腫瘍内外間質における血管・リンパ管密度（間質領域におけるマーカー陽性内皮の面積率）の上昇傾向所見を得た。本年度では、形態計測を継続するなかで、特に脈管間質の空間局在に注目して、病変組織の連続薄切切片の多重免疫染色情報に基づいた組織立体構築を進めた。この解析では癌胞巣周囲で増生する血管網、リンパ管腔の拡張と癌細胞塞栓を捉えるとともに、腫瘍内外間質の境界部での血管・リンパ管進入状況を定量・比較した。この3次元組織構造解析により、2次元画像で得られなかった癌実質―周囲間質境界領域における脈管分布と腫瘍伸展との関連（移植癌細胞株間の差異）を評価できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
癌環境の3次元構造解析については、CK陽性情報の画像演算（バーチャルスライドデジタル画像記録→NIH ImageJとRATOC TRI-SRF2ソフトウェアによる画像統合処理）に基づいて癌実質と胞巣内外間質領域を分画する予備検討を初年度から継続し、2年目となる本年度までに連続薄切切片（4μm厚、200枚）から構築した3次元組織空間での脈管間質の構造特性について詳細な解析を進めることができた。本解析の特長として3次元空間での陽性シグナル連結性に基づく微細な血管網を再現できたが、視覚表現では立体組織全体での超高密度の血管分布・走行の理解は困難であった。この経験から、視野中で連続する血管あるいは腫瘍間質内へ陥入する血管のみを分画・表示する観察手法を試行し、血管サイズや局在に基づく分類・比較に至っている。また、腫瘍最大割面での立体構築では癌胞巣と宿主間質との境界が細い帯状の円周面に限局されるため、周囲組織から癌胞巣内部へ進入する脈管形状を捉えにくい事実にも直面した。癌―宿主間質境界面情報を最大限に得る方策として、腫瘍塊の半側端部全域（本解析では円錐状に拡大伸展する腫瘍の舌尖側を選択）を立体構築することにより、半円形ドーム状に拡がる癌胞巣表面での血管・リンパ管貫通部の観察・密度計測も達成できた。この立体構築部位では浸潤拡大する腫瘍形状を把握することが可能となり、特にHO-1u1癌細胞株では神経線維束（ニューロフィラメント；NFP陽性）に沿って伸展する傾向が強いことも明らかにできた。
本年度では形態解析に係る画像処理アルゴリズム改善を優先し、計画課題としていた腫瘍伸展に関わる分子動態の解析、OSC19癌細胞株のリンパ管新生誘導能を活用した腫瘍リンパ管内皮細胞プロファイルの解析については最終年度での実施を予定している。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度では、癌細胞株の組織浸潤・リンパ節転移に関わる分子について、特にリンパ管内皮誘導能の顕著なOSC19癌細胞株に注目して、本年度までに得られた組織切片を使用して腫瘍分泌シグナルについて検索する。候補分子として、癌細胞のリンパ管浸潤（向リンパ走化性）に働くケモカイン回路（乳癌転移で主軸として働くCXCR4/CXCL12回路、頭頸部癌細胞の浸潤能を高めるCCR4/CCL22回路など）に注目して癌微小環境における局在、特にリンパ管との位置関係を明らかにする（添野・島津分担）。異なる癌細胞株による新生誘導されたリンパ管内皮性状の検証に向けて、腫瘍塊（移植後約2週間）からリンパ管内皮細胞を抽出（摘出腫瘍を酵素処理にて細胞剥離・懸濁し、抗Lyve1抗体および抗体結合磁性ビーズと磁気カラムで結合細胞を回収）、得られた細胞試料は分化マーカー発現の定量PCRおよび免疫組織化学で解析する（佐藤分担）。詳細な分子ネットワークを知る目的で、分離した腫瘍リンパ管内皮細胞および健常舌組織由来のリンパ管内皮細胞を対象としてマイクロアレイ解析も計画する（田谷分担）。
また、癌原発病巣が転移シグナルを発信している可能性（前転移ニッチの成立）に着目し、移植部位の脈管内に侵襲した癌細胞（および上皮形質を示さない細胞の免疫表現型）を組織観察するとともに、循環系に放出されたシグナル分子の輸送担体として担癌マウスの血清・エクソソーム画分の分子群（タンパク、ノンコーディングRNA分子）を分析する（添野分担）。この目的では、癌移植マウス心部からシリンジで循環血液を採取し、遠心分離（1,600xg）で血球成分を除去したのち、血清用精製カラムでRNA抽出する。エクソソームの分画では、血清試料を超遠心（100,000xg）した沈殿を回収し、酸性フェノール試薬でRNA抽出する。実施に際して、癌細胞株の同所移植試料とともに健常舌組織を比較対象として準備する。
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| Causes of Carryover |
課題計画当初と異なる点として、平成26年度では、共同研究者の異動に先立って作業過程を変更したため（画像解析の優先）、分子動態解析に係る経費として次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
計画していた分子動態解析を実施するため、免疫組織化学に必要な特異抗体及び関連試薬、遺伝子解析用試薬として、核酸抽出用試薬、 リアルタイムPCR用試薬とプライマー、その他細胞培養に要する消耗品経費に使用する。
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Research Products
(3 results)
