凍結保存歯の歯根膜細胞は高い増殖能を維持できるか

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25463073
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 小野 由起子 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (80345511)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 芳澤 享子 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (60303137)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 凍結保存 / 歯 / 歯根膜 / 幹細胞 / 培養 / 細胞工学 / 再生医療

Research Abstract

（１）凍結保存移植歯の作製と歯根膜細胞の培養
１）凍結保存歯の作製：４週齢雄性ラットを用いた。どの操作もセボフルレンで麻酔導入後、抱水クロラールを腹腔内投与して麻酔を施し、十分に徐痛が得られた状態で行った。上顎第一、第二臼歯を抜歯後、培養細胞用凍結保存液による緩慢凍結法、ガラス化急速凍結法を用いて凍結し、-80℃のディープフリーザおよび液体窒素でそれぞれ凍結保存を開始した。対照群には凍結しない上顎第一、第二臼歯を用いた。
２）歯根膜細胞の培養　（凍結保存歯群、非凍結保存歯群）：凍結保存1、3か月間の凍結保存歯および凍結していない歯の歯根膜をTemmerman L (Cell Tissue Bank 2008)、Oh YH (Cyrobiol 2005)らの手法に準じて採取、歯根膜細胞を培養した。すなわち、歯根膜を歯根上方1/3～1/4部からNo.15メスで切離して、24 wellの培養ディッシュに培地（Opti-MEM培地: 1%ペニシリン／ストレプトマイシン、5%FCS含有）を入れ、expansion techniqueで培養した。基本的に２回目の継代時に獲得した細胞を実験に用いた。非凍結保存歯の歯根膜細胞は培養して増殖させたあと通法通り凍結保存した。
（２）凍結保存歯の歯根膜細胞の増殖能の分析
コロニー形成能の評価：（１）の２）で獲得した歯根膜細胞をTypeIVコラーゲン処理した100mmディッシュに1000個／で播種し、細胞の染色を行い12日目のコロニー数と細胞数を計測した。細胞寿命の評価：連続継代培養を細胞増殖が止まるまで行い、細胞寿命（population doubling)を計測した。
緩慢凍結法、ガラス化法急速凍結法で凍結保存した歯の歯根膜細胞の増殖能は非凍結保存群と比較してほぼ同程度であった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

凍結保存歯の作製において培養細胞用凍結保存液による緩慢凍結法、ガラス化法急速凍結法による保存はおこなったものの、プログラムフリーザによる緩速凍結法、過冷却急速凍結法による凍結保存はこれからである。また凍結保存歯の歯根膜細胞の増殖能の分析までおこなったものの、TUNEL法によるアポトーシス細胞の検出、歯根膜幹細胞の分布についての免疫組織化学的、酵素組織化学的検索が途中である。

Strategy for Future Research Activity

今後はラットの上顎第一、第二臼歯をプログラムフリーザによる緩速凍結法、過冷却急速凍結法を用いて凍結し、-80℃のディープフリーザで1、3、6、9、12、24か月間凍結保存し、その歯根膜細胞の細胞増殖能を分析し、アポトーシス細胞の検出、歯根膜幹細胞の分布を検索する。また緩慢凍結法、ガラス化法急速凍結法によって凍結保存した歯の歯根膜細胞を培養して、細胞増殖能を分析するとともに、TUNEL法によるアポトーシス細胞の検出、歯根膜幹細胞の分布についての免疫組織化学的、酵素組織化学的検索を進めていく。非凍結保存歯から採取し、培養して各期間凍結保存したた歯根膜細胞についてもその増殖能、アポトーシス細胞数、歯根膜幹細胞の分布を検索していく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

購入予定であった過冷却冷凍システムを設置する予定であった実験室が次年度に移転することになりすぐに設置することができなくなったので、購入を次年度の実験室移転後に延期した。それにより過冷却冷凍システムを用いて行う予定であった実験も次年度に行うことになったため。
過冷却冷凍システムを購入し、それを用いた実験を行うための実験用動物の購入、飼育料の支払い、歯根膜細胞の培養のための試薬、器具、染色用試薬の購入に使用する。

Research Products

• [Journal Article] Autotransplantation or replantation of cryopreserved teeth: a case series and literature review. (2014)
  • Author(s): Yoshizawa M1, Koyama T, Izumi N, Niimi K, Ono Y, Ajima H, Funayama A, Mikami T, Kobayashi T, Ono K, Takagi R, Saito C.
  • Journal Title: Dental traumatology Volume: 30 Pages: 71-75
  • DOI: 10.1111/edt.12039.
  • Peer Reviewed