2013 Fiscal Year Research-status Report

新規培養法CTOSを用いた口腔癌に対する抗癌剤感受性試験の開発と耐性機構の解明

Research Project

Project/Area Number	25463110
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	高丸菜都美徳島大学, 大学病院, 助教 (40513031)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宮本洋二徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (20200214) 内田大亮徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (20335798) 玉谷哲也徳島大学, 大学病院, 講師 (30274236) 永井宏和徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (50282190)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	CTOS法 / 培養 / 抗癌剤感受性試験
Research Abstract	CTOS法での癌細胞の初代培養の確立を行っている。本研究をすすめるにあたり、徳島大学病院倫理委員会に本研究について審査してもらい承認を得た。患者への説明と同意を得た上で、研究を開始した。 CTOSのプロトコールに従って培養をおこなった。当科を受診した口腔癌患者で、本研究に対し、了承が得られた患者の臨床検体(手術検体および生検)の一部を１㎜程度の組織片になるように機械的に裁断した後、酵素的に処理した上で、 3種類の mesh filter(500nm~40nm) を順に通していき、organoid fraction と flow through fr action に分け、 organoid を stem cell 培養用の medium で培養した。CTOSの形成は非常に困難で、残念ながら、CTOS形成は全例では認められなかった。 organoid からCTOSが形成されたのは1例のみであった。プロトコールではCTOS形成されるまで24時間とのことであったが、24時間ではなめらかな球形状は呈さず、球形を呈すCTOS形成までに72時間を要した。また、他の癌での報告より形成率が悪く、手技的なものなのかCTOS形成にも時間を要していることより、細胞によるものなのかどうか苦慮してる状態である。1例CTOSが形成された症例で、ゲル内培養へ移行させ、さらに3次元培養へとすすめていっているところである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 倫理委員会の承認を得ることに時間を要してしまった。また、CTOS法樹立のためには、これまで治療歴もなく、抗癌剤や放射線療法など行われていない症例が適当であるが、これに該当する症例が少なかったことが理由として考えられる。また、CTOS形成が全症例でみられることがなく、形成される症例がこれまでに1例のみであったため、計画に対して遅れをとっているような状態である。
Strategy for Future Research Activity	・in vitroにおける抗癌剤感受性試験 CTOS 形成確認後、collagen gel に CTOS を埋め、抗癌剤(5-FU,CDDP,DOC)を添加し、1週間後に CTOS サイズとMTT assayにて抗癌剤感受性を評価する.MTT assayによる生細胞数は,micro plate reader(TECAN インフィニットF50R)を用いて570nmの吸光度で測定する. ・ in vivoにおける抗癌剤感受性試験マウス移植腫瘍は CTOSを Matrigel と混合した後、ヌードマウス(日本クレア)の背部皮下に移植する.腫瘍サイズが5~6mmに成った後,各種の抗癌剤 (5-FU,CDDP,DOC)を投与し、経時的な移植腫瘍のサイズの変化で抗癌剤の効果を評価する. ・抗癌剤感受性に関与する遺伝子の解析(担当:髙丸,宮本) 抗癌剤感受性細胞と非感受性細胞を用いて遺伝子の発現の解析を行う。両細胞からRNAを抽出し、遺伝子発現用マイクロアレイ(whole human genome, アジレント社)を行う。RNAの抽出はTRI zolを用いて行い、total RNAを回収する。得られたデータから必要な遺伝子の発現量の解析は、real-time PCR法を用いる。得られたデータは内部コントロールであるGAPDH mRNAを用いて標準化し、比較検討する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	研究計画が予定より遅延しており、前年度予定していたところまで研究が進んでいないため、次年度使用額が生じた。動物購入、飼育費等、培養や抗癌剤感受性試験に関する物品が必要となる。また、その結果でmiRNAの解析を予定しているためMicro arrayの予算も必要となる。