2014 Fiscal Year Research-status Report
人工ヌクレアーゼ（TALEN）を用いた遺伝子改変マウス作製法の超簡便化
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25463184
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
泰江 章博 徳島大学, 大学病院, 講師 (80380046)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / TALEN / CRISPR/Casシステム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ノックアウトマウスが四肢欠損を示す表現型評価の容易なFgf10を対象遺伝子として、TALENならびにCRISPR/Casシステムを用いた標的配列破壊をマウスの受精卵にて行った。Fgf10遺伝子を標的としたTALEN RNAをin vitroにおいて合成・精製し、マウス1細胞期胚にマイクロインジェクションを行った。一晩培養し、2細胞期に発生したものを偽妊娠マウス卵管に移植した。帝王切開により、胎生13.5～16.5日で胚を摘出し、その表現型ならびに遺伝子型を解析した結果、濃度によっては、50%近い確立で標的遺伝子配列の変異を認めたが、F0四肢欠損胚の獲得は10%に満たなかった。F0マウス同士の交配により、F1への生殖系列移行も示すことが確認された。
一方で、CRISPR/Casシステムを用いた標的配列破壊を、同様にマウスFgf10遺伝子で試みた。TALENで標的とした配列を含む3箇所に領域を設定し、guide RNAならびにCas9 RNAをin vitroにおいて合成・精製後、マウス1細胞期胚にマイクロインジェクションし、翌日、2細胞期に発生したものを偽妊娠マウス卵管に移植した。結果、摘出胚中、最大100%の効率でF0マウスに四肢欠損胚を認めた。
CRIPSR/Casシステムによる標的配列破壊を他の遺伝子（Pax6、Msx1）において試みたところ、それぞれ、眼の形成不全、歯の形成不全・口蓋裂の発症が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、計画として掲げていたTALEN RNAの受精卵へのマイクロインジェクションによる導入のみならず、CRISPR/Casシステムも同様の手法による導入で、標的遺伝子破壊を達成できた。
一方で、TALENならびにCISPR/Casシステムのエレクトロポレーションによる受精卵へのRNA導入は、現在試行段階であり、安定した結果には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
ほぼ、当初の計画通りに進行しており、今後はエレクトロポレーションによる受精卵へのRNA導入効率の上昇、ならびにssODNを併用したノックインマウスの作製を試みる。脊椎動物におけるヒト疾患モデル動物の作製にはノックインマウスの迅速作製の確立が必須である。
また、レポーター遺伝子といった比較的大きなDNAの導入の試みも併行する予定である。
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| Causes of Carryover |
本実験鋭角を遂行するに当たり、当該年度に購入予定であった発生工学的実験の関連試薬・消耗品が次年度購入予定に変更となったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２７年６月頃に関連試薬・消耗品などを購入予定である。
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