食品機能性成分の血管新生抑制ー評価法の開発と新規物質の探索

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25560034
• Research Institution: Ochanomizu University
• Principal Investigator: 山野 春子 お茶の水女子大学, 生活科学部, 研究員 (90242338)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 食品機能性成分 / 癌 / 血管新生抑制作用 / 血管内皮細胞 / VEGF / 共培養 / 管腔形成 / 糖タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

食品中には抗変異原性作用や抗酸化作用などの様々な機能をもつ食品成分が含まれていることに着目し、本研究は癌の増大や転移などに深く関与する血管新生に対して抑制作用をもつ食品成分の探索と評価を、新しく開発した評価法によって行うこととした。
新しい評価法として、当初は血管新生の研究に一般的に用いられてきたHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）に勝る応答性を示す、ラット肝内皮細胞の初代培養細胞を調製して用いる計画であった。この内皮細胞はHUVECに比べ、血管新生における重要な因子であるVEGF（Vascular endotherial growth factor）の受容体を十分に発現していることから、本研究に適すると考えた。しかし評価法として確立するには、この初代培養細胞を継代培養できるようにする必要があり、培養条件の検討を行ったが、検討課題が極めて多いことが明らかになった。
そこで新たな評価法として、血管内皮細胞を含む二種類の細胞をVEGF存在下で共培養し、出現する管腔形成を測定、解析する方法を検討した。管腔は制御因子の刺激により血管の基底膜や細胞外基質が分解され、内皮細胞が遊走、増殖、連結して三次元的な管腔構造をとることによって形成され、その後血管が成熟して血管新生が完成することから、この管腔形成の状態を調べる評価法は、血管新生の抑制作用をもつ食品成分の探索と評価に適した方法であると考えられる。
評価に際して、対照試料の管腔形成を十分に出現させるには、共培養の培養条件が重要となるため、共培養する細胞の組み合わせ、両細胞を播種する際の細胞数比率等の検討を重ね、最適な培養条件を得た。
今後は、血管内皮細胞間の接着部位に集積する糖タンパク質が管腔形成で発現することを利用し、この糖タンパク質のモノクローナル抗体を用いて解析を進め、血管新生の抑制作用をもつ食品成分の探索と評価を行う。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

食品中に存在する、血管新生の抑制作用をもつ食品成分を探索、評価するにあたり、新らしい評価法の開発とその評価法を用いた探索と評価を行うことを目指した。
当初は血管新生の研究に一般的に用いられてきたHUVECに勝る応答性を示す内皮細胞を、ラット肝から採取して培養し、この細胞を探索、評価に使用する計画であった。しかし、この初代培養細胞を継代培養できるようにする培養条件を検討したところ、課題が極めて多いことが明らかになった。
そこで、新しい評価法として、血管内皮細胞を含む二種類の細胞をVEGF存在下で共培養し、その際に出現する管腔の形成を測定、解析する方法を検討した。
この評価法を確立するに際して、共培養する細胞の組み合わせ、播種する細胞数比率等の培養条件の検討を行い、評価法を確立する目処を得たが、評価法を変更し新しい評価法の検討を行ったことにより、研究の進捗状況に遅れが生じ、変更後の評価法を用いた食品中の血管新生抑制作用をもつ食品成分の探索や評価に着手していない。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画に従い、今後は新しく検討した評価法を用いて、食品中に存在する血管新生の抑制作用をもつ食品成分の探索と評価を行う。
当初に開発した探索、評価法を変更し、新たな評価法として、VEGF存在下で血管内皮細胞を含む二種類の細胞の共培養を行い、その際に形成される管腔を、測定、解析する方法を検討した。
共培養する培養細胞の組み合わせ、播種する細胞数比率等の検討を行い、管腔を形成させる最適な培養条件を得たが、評価法を変更したことに伴い、研究の進捗状況に遅れが生じ、補助事業期間の延長を申請し承認された。
承認された補助事業延長期間を使い、VEGF存在下で評価対象となる食品成分を添加して共培養した場合に生じる管腔形成の状態を、管腔形成で発現する糖タンパク質のモノクローナル抗体を用いて解析し、血管新生の抑制作用をもつ食品成分の探索と評価を行う予定である。

Causes of Carryover

血管新生を抑制する作用をもつ食品成分の探索、評価法として、当初の計画では、ラット肝から採取する内皮細胞を使用する予定であったが、この初代培養細胞を継代培養できるようにするには、極めて課題が多いことが明らかになったことから、探索、評価法の見直しを図り、VEGF存在下で血管内皮細胞を含む二種類の細胞を共培養し、その際に形成される管腔の測定、解析を行うことによって抑制作用を評価する新たな評価法を確立することとした。
評価法の見直しを図った結果、研究の進捗に遅れが生じ、補助事業期間の延長を申請し承認されたため、次年度の研究に使用する試薬類で、使用保証期限が短い培地や試薬等を、次年度に購入する必要が生じた。
また、当初申請額に対し交付額が減額されているため、27年度に実験補助および資料整理のための研究協力者の謝金として計上した額は、研究代表者がすべて実施したため、使用せずに次年度使用額とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は、VEGF存在下で血管内皮細胞を含む二種類の細胞を共培養する際に形成される管腔の測定、解析を行う新しい評価法を確立し、この評価法を用いて、当初の計画である食品中に存在する血管新生の抑制作用をもつ食品成分の探索と評価を行う。
この実験計画を遂行するために必要な細胞、培地、抗体をはじめとする試薬等の消耗品類の購入費および資料収集、研究成果発表のための旅費、研究成果投稿料に次年度使用額を使用する計画である。