2013 Fiscal Year Research-status Report
出芽酵母の胞子形成時におけるRNAエピジェネティクス
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25620125
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 勉 東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20292782)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ＲＮＡエピジェネティクス / m6A / 胞子形成 |
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| Research Abstract |
抗m6A抗体の特異性および免疫沈降の条件を検討するために、大腸菌のトータルRNAに対し、免疫沈降を行ったところ、37位にm6A修飾を持つtRNAValが特異的に沈降することを確認し、回収率や精製度から抗体量や洗浄の条件などの検討を行った。次に酵母SK1株を用いて、胞子形成を誘導後、m6A修飾酵素であるIME4の発現量が最大になる3時間後にtotal RNAを回収して、オリゴdTビーズによるpolyA(+)RNA画分の濃縮を二回行った。RNAの断片化の条件検討を行い、ポリアクリルアミドゲルで分離したのちに50-100塩基長のRNA断片を切り出し抽出した。ScriptSec v2 RNA-seq (Epicentre)を用い、Strand-specificなcDNAを作成した。cDNAの品質をバイオアナライザーで確認後、イルミナ社のシーケンサーで解析した（国立遺伝研の豊田敦先生との共同研究）。得られたリードをSK1のゲノムに張り付けたところ、リードの張り付き方にむらがあることが判明し、cDNAを再調製することになった。in vitroにおけるm6A修飾の再構成を行うために、メチル化酵素であるIme4pとそのパートナータンパク質であるMum2pおよびSlz1pの組換えタンパク質の発現と精製を行っている。さまざまなタグと発現系を検討したところ、SUMOタグを用いた大腸菌の発現系で可溶性が大幅に向上した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Strand-specificなcDNA化が予想外に難航することが判明した。また、m6A-seqの解像度を向上させるためにはcDNAの平均長を短くすることが重要であるが、その際に生じるバイアスも結果に影響していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
m6A-seqの検討を続けながら、in vitroでのm6A修飾の再構成をめざし、in vitroメチル化による修飾部位の同定法の確立にも活路を見出したいと考えている。
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Research Products
(15 results)
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[Journal Article] A biochemical landscape of A-to-I RNA editing in the human brain transcriptome2014
Author(s)
Sakurai, M., Ueda, H., Yano, T., Okada, S., Terajima, H., Mitsuyama, T., Toyoda, A., Fujiyama, A., Kawabata, H. and Suzuki, T.*
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Journal Title
Genome Res.
Volume: 24
Pages: 522-534
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] PARN mediates 3’-end trimming of Argonaute2-cleaved precursor microRNAs2013
Author(s)
Yoda, M., Cifuentes, D., Izumi, N., Sakaguchi, Y., Suzuki, T., Giraldez, A.J. and Tomari, Y.
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Journal Title
Cell Reports
Volume: 14
Pages: 715-726
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Distinct tRNA modifications in the thermo-acidophilic archaeon, Thermoplasma acidophilum2013
Author(s)
Tomikawa, C., Ohira, T., Inoue, Y., Kawamura, T., Yamagishi, A., Suzuki, T. and Hori, H.
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Journal Title
FEBS Lett.
Volume: 587
Pages: 3575-3580
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Measurement of tRNA 2-methylthio modification by quantitative PCR for assessing type 2 diabetes risk2013
Author(s)
Xie, P., Wei, F.-Y., Hirata, S., Kaitsuka, T., Suzuki, T., Suzuki, T. and Tomizawa, K.
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Journal Title
Clinical Chemistry,
Volume: 59
Pages: 1604-1612
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Crystal structure of a putative methyltransferase SAV1081 from Staphylococcus aureus2013
Author(s)
Kita, S., Tanaka, Y., Hirano, N., Kimura, S., Suzuki, T., Suzuki, T., Yao, M. and Tanaka, I.
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Journal Title
Protein & Peptide Letters,
Volume: 20
Pages: 530-537
DOI
Peer Reviewed
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