2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞周期特異的局在性を利用した卵子特異的リプログラミング因子の網羅的探索
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25640051
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
外丸 祐介 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 教授 (90309352)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 友宏 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (80153485)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 発生工学 / リプログラミング因子 / クローン動物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
核移植によるクローン動物の作製効率の改善に向け、ドナー核がリプログラムされるメカニズムやその誘導因子（リプログラミング因子）の解明に取り組んでいる。本課題では、「標的因子は卵子内で局在性を示す」という仮説を基に、「核を除去した間期の卵子細胞質には存在せず、その除去した核を含む細胞質に存在し、且つ未受精卵細胞質中に存在するタンパク質」の分離・解析を実施することで、卵子特異的なリプログラミング因子の探査にあたる。
平成26年度においては、前年度より引続いて、標的タンパク質を分離・解析するための材料収集作業を行い、マウスの未受精卵3,239個、間期受精卵（前核期卵）2,800個、核を除去した前核期卵の細胞質およびその周辺細胞質5,042個（組）を収集するに至った。先ず、未受精卵および核を除去した前核期卵の細胞質を解析の対象とすることとして、BCA 法によりタンパク質定量を実施した結果、それぞれ約35.0μgおよび24.0μgであった。次に、これらをiTRAQ 試薬でラベルした後にLC-MS/MS分析に供してタンパク質発現・相対定量解析（株式会社アプロサイエンスに依託）を実施した結果、825種類のタンパク質を検出することができ、818種類について定量的比較が可能であった。本研究で標的とするタンパク質は「核を除去した前核期卵の細胞質と比較して、未受精卵に多く存在する」ものであり、818種類中93種類がこれに該当した。特に1.5倍以上のものは2種類あり、最大比（2.812倍）のものをリプログラミング因子の第一候補とした。現在、卵子・受精卵・細胞における遺伝子発現と免疫染色による分布を確認中であり、同時にリプログラミング能力の検証に向けて発現ベクターの構築を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画では、本研究における標的タンパク質を分離・解析するためには150μg程度のタンパク質を得る必要があり、マウス卵子1個あたりのタンパク質量を30ng程度と見込み、未受精卵5,000個程度、間期受精卵（前核期卵）5,000個程度、核を除去した前核期卵の細胞質10,000個程度、ならびに前核期核とその周辺細胞質15,000個程度の収集を目標とした。その後に得たタンパク質分析に関する新規情報により、当初予定していたタンパク質分離手段の2倍程度の分解能を持つ新規手段を利用できることがわかり、材料の収集目標数を当初計画の半分程度とした。この材料収集を初（平成25）年度中に完了する予定であったが、材料採取担当として予定していた人員（連携研究者）の確保、ならびに当初の想定に比して材料採取効率（マウス受精卵採取と顕微操作作業の効率）の見込み違い等の理由から、この予定を達成することができなかった。この為、次の行程であるタンパク質の分離・解析に開始時期について、当初計画からは約6ヶ月程度の遅滞を生じ、現時点でもこの遅滞分が当初研究予定に対する遅れとなっている。
しかしながら、その後にこれらの問題は改善・解決され、平成26年度中に材料採取およびタンパク質の分離・解析は順調に進展することで完了した。また、次のステップであるリプログラミング因子の候補遺伝子の選抜、卵子・受精卵・細胞における遺伝子発現と免疫染色による分布の確認、ならびにリプログラミング能力の検証に向けて発現ベクターの構築に着手するに至っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
標的タンパク質を分離・解析の材料採取の行程において当初計画に遅延が生じたが、その後の進捗は順調であり、リプログラミング因子の候補を選抜する為の基盤データとなるタンパク質発現・相対定量解析（iTRAQ 試薬でラベルした後にLC-MS/MS分析）の結果が得られている。定量的な比較が可能であった818種類のタンパク質の内、本研究で標的とする「核を除去した前核期卵の細胞質と比較して、未受精卵に多く存在する」ものとして93種類が該当した。計画当初は、定量比が比較的大きいと考えられる2.0倍以上のものが複数検出されると想定していたが、本解析では１種類（2.812倍）だけであった為、リプログラミング因子の候補としてこれに注力して今後の研究を進める予定である。
現在、卵子・受精卵・細胞における発現と免疫染色による分布を確認中であり、また、この候補のリプログラミング能力を検証する為、発現ベクターの構築を進めている。以降は、卵子および細胞でその発現と活性を確認した後、クローン胚作製行程への適用をはかることで初期発生・胎仔発生における効果・影響を解析する計画である。また、この候補における単体ではリプログラミング能力を確認できない場合には、関連タンパク質・遺伝子群の生物的機能、および代謝経路やシグナル伝達系といった生物学的なパスウェイについてDAVIDデータベース等を利用してアノテーション解析を行い、その情報を元に別途候補を擁立や相乗・複合的効果の解析へ移行する計画である。
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| Causes of Carryover |
本研究における標的タンパク質を分離・解析する為の材料収集を初（平成25）年度中に完了する予定であったが、材料採取担当として予定していた人員の確保、ならびに当初の想定に比して材料採取効率の見込み違い等の理由から、この予定を達成することができなかった。この為、次の行程であるタンパク質の分離・解析に開始時期について、当初計画からは約6ヶ月程度の遅滞を生じたが、その後にこれらの問題は改善・解決され、平成26年度中に材料採取およびタンパク質の分離・解析は順調に進展することで完了したことから、概ね実施研究内容に沿った研究費を使用した。しかし、現時点でもこの遅滞分が当初研究予定に対する遅れとなっている為、約80千円の次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の研究実施予定に対する遅れにより約80千円の次年度使用額が生じたが、その後にこの問題は改善・解決されて順調に進展している。今後は、予定している研究内容の実施に加えてその全体の進捗を若干早める計画であることから、平成27年度の予定使用額に加えて、この次年度使用額も使用する予定である。
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