染色体特異的にクラスターを形成しているトラップジーン（CSCT）の解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25640052
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (90211705)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: クラスター遺伝子 / 染色体特異的 / マウス / 遺伝子トラップ / ゲノム編集 / EGTC / CSCT

Research Abstract

我々は、『可変型遺伝子トラップ法』を開発し、データベース『EGTC』（Databese for the Exchangeable Gene Trap Clones）を全世界に公開している。トラップした遺伝子のアノテーションを行う過程において、染色体特異的にクラスターを形成している新規遺伝子（Chromosome Specific Clustered Trap gene: CSCT）を発見した。プロモータートラップシステムなので、これらのクラスター遺伝子は少なくともES細胞で発現していることが分かる。本研究の目的は、染色体特異的にクラスターを形成しているトラップジーンに関して、クラスター全体を欠損したES細胞を作製してin vitroの解析を行うと同時に、キメラマウスを作製してノックアウトマウスラインを樹立し、個体レベルの表現型解析を行い、これらの新しい遺伝子群の生理機能を明らかにすることである。
EGTCに登録しているトラップクローンの中に、染色体特異的なクラスター遺伝子をトラップしているものは少なくとも39クローン（10遺伝子）存在する。本研究においては、クラスター中に含まれるRefSeqの数が最も少ないAyu21-B145 (CSCT9)に焦点を絞り、解析を行う。CSCT9は、マウス13番染色体上の約1.6 Mbpの範囲に全て収まっているので、その領域を全て欠損させる。
当初はクラスター領域の上流側と下流側にそれぞれloxP配列をジーンターゲッティング技術でノックインする予定だったが、最近急速に発展しているゲノム編集技術を用いて、一気に欠損させる事にした。
また、クラスター内に存在するRefSeq遺伝子、および外側で隣接している遺伝子の、ES細胞における発現をチェックした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成２５年度は、研究代表者自身が論文博士号を取得するという目標を立て、『Development and analysis of the Exchangeable Gene Trap Clones (EGTC)』というタイトルで熊本大学大学院生命科学研究部に学位申請を行い、生命科学博士号を取得した。そのため、本研究への取り組みが遅くなった事は否定できない。
しかしながら、ゲノム編集技術を活用する事で、通常のジーンターゲッティング技術を用いる当初の計画よりもスピードアップしており、既にクラスター領域全体を欠損させたES細胞株の候補を得る事が出来た。現在、野生型Cas9を用いて得た48クローンと、変異型Cas9(D10A)を用いて得た48クローンの候補ES細胞株の解析を行っているところである。
また、クラスター領域内のRefSeq遺伝子は、その多くがマウスES細胞においてほとんど発現していなかった。しかしながら、その中のひとつであるZfp640遺伝子に関してはES細胞で発現している事を確認した。Zfp640は、Sorianoグループのジーントラップマウスのホモ接合体において骨形成などに異常があったという記載がMGIに登録されている。この遺伝子に関しても、クラスター内に複数コピー存在しており、単純にトラップしただけで表現型がでるというのは予想外であったが、このことからCSCT9 KOマウスにおいても同様な表現型が観察される可能性が高い。
さらに、クラスター領域の外側で隣接しているUqcrb遺伝子について、マウスES細胞での発現を検討している。

Strategy for Future Research Activity

クラスター領域全体を欠失させたES細胞株の解析を行う。ES細胞レベルの表現型観察と併行して、キメラマウス作製、マウスライン樹立を行い、個体レベルの表現型解析を行う。
また、クラスター内に存在するZfp640, Gm10324, Ayu21-B145および隣接しているUqcrb遺伝子の、ES細胞及びマウス個体における発現パターンを詳細に解析し、CSCT9 KOマウスの表現型との相関を調べる。正常マウスにおけるCSCT9などの転写レベルが非常に低いにも係らず何らかの表現型が観察された場合、CSCT9はRNAまたはタンパク質としてではなく、ゲノム上のDNA配列そのものが機能している可能性を示唆しており、その可能性を検討する。
さらに、クラスター領域内、及びその周辺領域のエピジェネティックな修飾がどうなっているのかを解析し、表現型との相関を検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

（１）平成２５年度は、研究代表者自身の学位取得を最大の目標としたため、本研究への取り組みが遅くなった。
（２）研究代表者が獲得している科研費基盤研究B『可変型遺伝子トラップクローンを利用したCre-driverマウスの作製』（平成２３～２５年度）で雇用している技術補佐員を、平成２６年度は本研究費で雇用する事を想定し、平成２５年度に受領した金額の一部を使用せずに残す事にした。
（３）平成２５年度の学会参加費は、前記基盤Bから支出した。
これまで基盤Bの研究テーマについて働いていた技術補佐員を本研究テーマにつけ、研究のスピードアップを図る。そのために人件費・謝金（約６０万円）を支出する。それ以外は、当初の計画通り、物品費（約９０万円）、旅費（約１０万円）、その他（約１０万円）に使用する。

Research Products

• [Journal Article] The intramembrane proteases Signal-peptide-peptidase-like 2a and b (SPPL2a/b) have distinct functions in vivo. (2014)
  • Author(s): Schneppenheim, J., Hutti, S., Mentrup, T., Lullmann-Rauch, R., Rothaug, M., Engelke, M., Dittmann, K., Dressel, R., Araki, M., Araki, K., Wienands, J., Fluhrer, R., Saftig, P. and Schroder, B.
  • Journal Title: Mol. Cell. Biol. Volume: 34 (8) Pages: 1398 - 1411
  • DOI: 24492962
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Database for exchangeable gene trap clones: Pathway and gene ontology analysis of exchangeable gene trap clone mouse lines. (2014)
  • Author(s): Araki, M., Nakahara, M., Muta, M., Itou, M., Yanai, C., Yamazoe, F., Miyake, M., Morita, A., Araki, M., Okamoto, Y., Nakagata, N., Yoshinobu, K., Yamamura, K. and Araki, K.
  • Journal Title: Dev. Growth Diffr. Volume: 56 (2) Pages: 161 - 174
  • DOI: 24444128
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] VMAT2 identified as a regulator of late-stage beta-cell differentiation. (2014)
  • Author(s): Sakano, D., Shiraki, N., Kikawa, K., Yamazoe, T., Kataoka, M., Umeda, K., Araki, K., Mao, D., Matsumoto, S., Nakagata, N., Anderson, O., Stainier, D., Endo, F., Kume, K., Uesugi, M. and Kume, S.
  • Journal Title: Nat. Chem. Biol. Volume: 10 (2) Pages: 141 - 148
  • DOI: 24316738
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation and analysis of serine protease inhibitor kazal type 3-cre driver mice. (2014)
  • Author(s): Sakata, K., Ohmuraya, M., Araki, K., Suzuki, C., Ida, S., Hashimoto, D., Wang, J., Uchiyama, Y., Baba, H. and Yamamura, K.
  • Journal Title: Exp. Anim. Volume: 63 (1) Pages: 45 - 53
  • DOI: 24521862
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction of CD99 with its paralog CD99L2 positively regulates CD99L2 trafficking to cell surfaces. (2013)
  • Author(s): Nam, G., Lee, YK., Lee, HY., Ma, MJ., Araki, M., Araki, K., Lee, S., Lee, IS. and Choi, EY.
  • Journal Title: J. Immunol. Volume: 191 (11) Pages: 5730 - 5742
  • DOI: 24133166
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TASK-2: a K2P K(+) channel with complex regulation and diverse physiological functions. (2013)
  • Author(s): Cid, LP., Roa-Rojs, HA., Niemeyer, MI., Gonzalez, W., Araki, M., Araki, K. and Sepulveda, FV.
  • Journal Title: Front Physiol. Volume: 29 July Pages: 198
  • DOI: 23908634
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HOT1 is a mammalian direct telomere repeat-binding protein contributing to telomerase recruitment. (2013)
  • Author(s): Kappel, D., Butter, F., Benda, C., Schelbe, M., Draskovic, I., Stevense, M., Novo, CL., Basquin, C., Araki, M., Araki, K., Krastev, DB., Kittler, R., Jessberger, R., Londofio-Vallejo, JA., Mann, M. and Buchholz, F.
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 32 (12) Pages: 1681 - 1701
  • DOI: 23685356
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Gene-trap mutagenesis using Mol/MSM-1 embryonic stem cells from MSM/Ms mice. (2013)
  • Author(s): Nakahara, M., Tateyama, H., Araki, M., Nakagata, N., Yamamura, K. and Araki, K.
  • Journal Title: Mamm. Genome Volume: 24 Pages: 228 - 239
  • DOI: 23604909
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ectopic Expression of Ptf1a Induces Spinal Defects, Urogenital Defects, and Anorectal Malformations in Danforth's Short Tail Mice. (2013)
  • Author(s): Semba, K., Araki, K., Matsumoto, K., Suda, H., Ando, T. Sei, A., Mizuta, H., Takagi, K., Nakahara, M., Muta, M., Yamada, G., Nakagata, N., Iida, A., Ikegawa, S., Nakamura, Y., Araki, M., Abe, K. and Yamamura, K
  • Journal Title: Plos Genetics Volume: 9 Pages: e1003204
  • DOI: 23436999
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 遺伝子トラップマウスを用いたlincRNAの機能解析 (2013)
  • Author(s): 中原舞、山添史雅、柳井千佳、吉信公美子、山村研一、荒木正健、荒木喜美
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 可変型遺伝子トラップクローンの進展 (2013)
  • Author(s): 吉信公美子、來海葉子、慶田貴子、古閑成美、中原舞、山村研一、荒木喜美、荒木正健
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] Analysis of gene-trap mouse lines trapping long non-coding RNA genes. (Part 1) (2013)
  • Author(s): 柳井千佳、山添史雅、中原舞、宮家幹子、森田彩香、荒木美幸、岡本頼幸、伊東春香、山村研一、吉信公美子、荒木正健、荒木喜美
  • Organizer: 第27回モロシヌス研究会
  • Place of Presentation: 筑波山 江戸家
  • Year and Date: 20130628-20130629
• [Presentation] Analysis of gene-trap mouse lines trapping long non-coding RNA genes. (Part 2) (2013)
  • Author(s): 山添史雅、柳井千佳、中原舞、宮家幹子、森田彩香、荒木美幸、岡本頼幸、伊東春香、山村研一、吉信公美子、荒木正健、荒木喜美
  • Organizer: 第27回モロシヌス研究会
  • Place of Presentation: 筑波山 江戸家
  • Year and Date: 20130628-20130629
• [Presentation] 可変型遺伝子トラップクローンを利用したCre-driverマウスの作製 (2013)
  • Author(s): 荒木喜美、森田彩香、宮家幹子、吉信公美子、來海葉子、慶田貴子、古閑成美、中潟直己、村上亜弓、門田雅世、目加田和之、吉木淳、荒木正健
  • Organizer: 第60回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場
  • Year and Date: 20130515-20130517
• [Remarks] EGTC
  • URL: http://egtc.jp