2013 Fiscal Year Research-status Report
O-GlcNAc化を定量的・定性的に解析する新たな基盤的技術の開発
| Project/Area Number |
25650003
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
久保田 裕二 東京大学, 医科学研究所, 助教 (70614973)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
|
| Keywords | 翻訳後修飾 |
|---|
| Research Abstract |
【1. O-GlcNAcされた蛋白質を選択的に分離して定量化する技術の開発】
本年度では標準的SDS-PAGE(Laemmli法)をベースとして、O-GlcNAc化蛋白質を精度よく分離する泳動条件の検討を行った。担体やバッファーの組成、電圧や温度、サンプルのアプライ量などを変更して試行した結果、初期条件と比較して、O-GlcNAc化蛋白質画分をより明瞭なバンドシフトとして分離・検出する事に成功した。
【2. O-GlcNAc化された蛋白質分子を大量精製する技術の開発】
まず、既にO-GlcNAc化が報告されている様々な蛋白質について、本技法が適用可能か検討した。その結果、当初用いたO-GlcNAc化基質蛋白質よりも、更に長いアミノ酸配列を有する基質分子に対しても、in vitroでのO-GlcNAc化が効率よく導入できる事を確認した。また、O-GlcNAc化された蛋白質の収率を向上すべく、大腸菌の培養条件（培地組成、IPTG濃度、培養温度、反応時間など）を複数検討した結果、より本法に最適なアッセイ条件を見出す事が出来た。
【3. 細胞内の蛋白質O-GlcNAc化を選択的に亢進・増強させる手法の開発】
本年度は、OGTのTPR [Tetratricopeptide repeat (TPR) domain]領域について系統的な欠損変異体を作製し、細胞内に発現させる事で標的蛋白質（代表的基質としてTab1）を効率よくO-GlcNAc化するのに必須なOGT分子領域を決定した。また、上記検討で同定されたOGT分子領域について、更に詳細な変異体系列を作製することで、細胞内でより高い蛋白質安定性とO-GlcNAc化効率を示す条件を見出す事に成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、各種新規技術開発のための基盤的研究（各種実験の基礎的データ収集・条件の最適化）を主として実行した。その結果、各技法において一定のデータ精度と再現性を得るための実験条件を決定する事に成功した。これは、当該O-GlcNAc化解析技術を応用し発展させる上で、極めて重要な意味を有していると考えられる。今後、これらの新規解析技術を複数の代表的O-GlcNAc化蛋白質で試すと共に、vivoでの詳細な検討を行うことで、その有用性と汎用性が確認できると思われる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
【1. O-GlcNAcされた蛋白質を選択的に分離して定量化する技術の開発】
本年度の成果を基に、生体内の様々な分子のO-GlcNAc化レベルが、細胞に各種刺激を与えることで変化するか、また癌細胞で異常が認められるか、本技法を用いて観察する。具体的には、疾患遺伝子の発現や細胞刺激時におけるO-GlcNAc化の定量的変化を観察すると共に、リン酸化やユビキチン化などといった他の翻訳後修飾とのクロストークについて、ウェスタンブロット法等を利用して解析する。
【2. O-GlcNAc化された蛋白質分子を大量精製する技術の開発】
本法によって得られた蛋白質のO-GlcNAc修飾が、in vivoにおいても同アミノ酸残基に生じている事を確認する事で、本技法の妥当性を図る。代表的なO-GlcNAc化蛋白質を本技法によって大量精製した後、LC-MS/MSにより修飾残基を同定して比較する予定である。また、他の様々な基質蛋白質についても同操作を実行し、新規O-GlcNAc修飾部位の同定を試みる。
【3. 細胞内の蛋白質O-GlcNAc化を選択的に亢進・増強させる手法の開発】
当該O-GlcNAc化亢進技術の、標的基質に対する特異性を観察する。まず、当該技術を用いた変異型OGTを細胞内に高発現させた後、その破砕液に存在する多様なO-GlcNAc基質蛋白質のO-GlcNAc化状態を、WGA-HRPやO-GlcNAc特異的抗体など各種プローブを用いて検証する。更に、本法によりO-GlcNAc化が亢進された標的蛋白質の機能活性や細胞内局在を観察することで、当該修飾が標的分子にどのような生理的意義を与えているのかを検討する。また、今回代表として使用した蛋白質のみならず、O-GlcNAc化標的として知られるその他複数の蛋白質についても同様の検討を行う事で、本技法の汎用性と有用性を確認する。
|
