2014 Fiscal Year Annual Research Report
O-GlcNAc化を定量的・定性的に解析する新たな基盤的技術の開発
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25650003
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
久保田 裕二 東京大学, 医科学研究所, 助教 (70614973)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 翻訳後修飾 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
以下の三点について、前年度までの知見を基として引き続き並行して研究を行った。
【1. O-GlcNAcされた蛋白質を選択的に分離して定量化する技術の開発】本法が代表的O-GlcNAc化蛋白質（Tab1）のみならず、様々なO-GlcNAc化蛋白質の分離・検出に適用可能か検討した。まず、既知の様々なO-GlcNAc化蛋白質について、各遺伝子をヒト細胞発現用ベクターにサブクローニングし、これらをヒト培養細胞に一過的に発現させた。その破砕溶液を本法にて分離した結果、O-GlcNAc化修飾を受けた様々な基質蛋白質が本電気泳動法において特徴的な移動度を示す事を確認した。その一方で、これらの蛋白質をOGA（O-GlcNAcase）と共に細胞に遺伝子導入し、強制的に脱O-GlcNAc化したところ、上述の移動度の遷移が完全に消失する事も確認した。
【2. O-GlcNAc化された蛋白質分子を大量精製する技術の開発】前年度に決定した培養条件下において、特定のO-GlcNAc化蛋白質を大量精製することに成功した。また、上記１の方法を用いる事で、この精製蛋白質のほぼ全てがO-GlcNAc化修飾を受けていることを確認した。さらに、質量分析により同O-GlcNAc化蛋白質の修飾アミノ酸残基を複数同定することに成功した。
【3. 細胞内の蛋白質O-GlcNAc化を選択的に亢進・増強させる手法の開発】本法が、代表的O-GlcNAc化蛋白質として用いたTab1以外の基質分子に対しても適用可能か検討した。上記１にて使用した既知O-GlcNAc化基質分子を複数選択して細胞内に発現させた後、O-GlcNAc化検出プローブを用いて同法の効果を検証した。その結果、Tab1を用いた場合と同様に、様々な基質分子に対しても、O-GlcNAc修飾が高効率で導入される事を確認した。
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Research Products
(7 results)
