PRRS感染耐過ブタ由来ファージ抗体ライブラリを用いた中和エピトープの探索

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25660226
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 五十嵐 樹彦 京都大学, ウイルス研究所, 教授 (90467431)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ウイルス / ブタ / ワクチン / 抗体 / ファージディズプレイ / 中和 / ライブラリー

Outline of Annual Research Achievements

ブタ繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)は現在、現在、養豚業に最も甚大な経済的被害をもたらしているウイルス性疾患である。妊娠豚及び肥育豚が本ウイルス(PRRSV)に感染すると繁殖障害、間質性肺炎を伴う発育不良等重篤な病態を呈するが、成豚では呼吸器症状を呈するものの、耐過する事が知られている。また、感染耐過個体から調製した抗体の受身免疫で感染防御可能な事も知られている。感染耐過個体が誘導する抗体を詳細に解析する事でより有効な抗PRRSVワクチンの免疫原を同定するため、耐過個体からファージディスプレイ法による抗体ライブラリーを作製する事を目的とした。
弱毒化PRRSVを免疫後、野性型ウイルスの攻撃接種を制御した個体から脾臓、リンパ節細胞及び白血球を調製し、そこから総RNAを抽出した。抗体分子重鎖及び軽鎖可変域をコードするDNA断片をPCR法により増幅、リンカー配列を介して直鎖状に連結した分子を合成し、ファージミドベクターに組み込みライブラリーを作製した。また、ウイルス粒子を抗原とするELISAの系を構築し、感染ブタの抗体と反応することを確認した。作製したライブラリーからウイルス粒子抗原に結合する性質を持つ抗体分子を第一段選抜し、次いでウイルス感染性を中和する性質を持つ分子を選抜する。この分子が認識する抗原決定基を同定する事で、個体感染の文脈においてウイルス複製抑制に真に有用な免疫原を明らかに出来る。この免疫原をワクチンに用いる事で、生ワクチン接種における潜在的問題であるワクチン株の持続感染及び病原性復帰変異の心配のないワクチン開発への道が開かれると期待される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

抗体分子重鎖および軽鎖可変領域をクローニングするにあたり、米国スクリプス研究所が開発したファージミドベクターの分与を受け本研究に用いる予定であったが、授受契約の際に行き違いがあり、入手までに予想以上に時間を要した。また、これを用いてPRRSV感染耐過ブタファージディスプレイ抗体ライブラリー（約百万クローン）から、PRRSV粒子を用いてパンニングを行い１次スクリーニングしたところ、PRRSV粒子に結合する抗体分子は得られなかった。

Strategy for Future Research Activity

抗体ライブラリーのスケール・ベクターへの組込方等の作製方法や、パンニングによる濃縮ステップの条件検討を詳細に行ってPRRSV抗原に結合する抗体を選択する。そして、そのPRRSVに対する中和活性を測定する解析を行う。これらの検索を通して、感染耐過個体で誘導される「機能的」抗体及びそれらの認識する抗原決定基を同定する。

Causes of Carryover

２６年度にブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）感染ブタファージディスプレイ抗体ライブラリー（約百万クローン）から抗PRRSV抗体をELISA法により選択、中和活性を検索した結果を日本ウイルス学会で発表予定であったが、抗PRRSV抗体がELISA法で検出されなかった為、計画を変更し、抗体ライブラリースケール及びパンニングによる濃縮ステップの検討を行う事としたため未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

抗体ライブラリーの作製方法やパンニングによる濃縮ステップの条件検討を行ってPRRSV抗原に結合する抗体を選択し、そのPRRSVに対する中和活性を測定する解析を行い、その結果を２７年度の日本ウイルス学会で発表することとし、未使用額はその経費に充てる。