ダイレクト・リプログラミングによる皮膚繊維芽細胞から血液細胞への分化誘導

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25660245
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Azabu University
• Principal Investigator: 久末 正晴 麻布大学, 獣医学部, 准教授 (80333144)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土屋 亮 麻布大学, 獣医学部, 教授 (30188586) ; 鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (40453138)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 血液 / 骨髄 / 皮膚 / 線維芽細胞 / 分化

Research Abstract

平成25年度は、イヌ皮膚繊維芽細胞を分離・培養してレンチウイルスベクターを用いて、Oct4を導入し、KSR、グルタミンおよびβ-Mercaptoethanolを添加した培地にて、まずCD45陽性細胞群への分化誘導を行うことを目的とした。特に、成犬個体からの分化誘導できる適切な条件検討を主眼としてその条件を模索した。また、同時に造血細胞の分化能を検討するため犬骨髄組織を採取し、メチルセルロース寒天培地およびmethylcellulose mediumにてコロニーフォーミングアッセイの適切な条件検討を行った。
健常犬から麻酔下にて皮膚組織を採取し細断の後に10%FBS添加DMEMにて培養を行った。2ないし3週間後に培養細胞を回収し線維芽細胞を分離した。繊維芽細胞採取の前処置としてDMEMにてヒトの皮膚の再生に有効な胎盤抽出物（プラセンタ）を用い、皮膚組織中のCD34陽性細胞の増加する条件を検討した。その結果、DMEMにて線維芽細胞を確保することは可能であったが、培養日数に長期の時間を要することと必要な細胞数を十分に確保することは困難であった。次に、プラセンタ製剤を添加した条件にて線維芽細胞の培養を実施したところ、線維芽細胞の増殖は濃度依存性に抑制されることが明らかとなり、培養初期では不適であった。
これら手法では線維芽細胞の適切な培養は行われず現在培養条件や分化誘導法の条件を検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

効率の良い皮膚線維芽細胞の培養条件を検討しているものの、個体によって大きな差異があり安定化していない。これは、採取する動物の年齢に依存することが考えられ現在適切な年齢や前処置方法を検討している。また、皮膚の再生に有効とされていたプラセンタを添加して線維芽細胞の培養を実施したところ、線維芽細胞の増殖は濃度依存性に抑制されることが明らかとなり、培養初期では不適であった。したがって、当初の計画の変更を余儀なくされている状態である。

Strategy for Future Research Activity

効率の良い皮膚線維芽細胞の培養条件については、FGFやEGFの添加を考慮しており現在実施中である。また、現在イヌ胎児の入手を進めており、犬の繊維芽細胞の入手と大量培養を模索している。
また、methylcellulose mediumにてコロニーフォーミングアッセイの適切な条件検討を確立し、線維芽細胞から血液細胞への分化誘導が可能になった場合の検討事項について順次準備を進め研究の遅延を最小限にするよう努力している。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初予定した線維芽細胞の培養条件が適切でなく分化誘導細胞の解析が遅れている。したがって、これらに該当する費用等が平成25年度に未執行となった。
細胞分化が成功次第、線維芽細胞由来の血液細胞の解析を実施する。
これらには、フローサイトメトリーによるCD45およびCD34などの造血細胞特異的マーカーの解析や、造血細胞に特異的な遺伝子発現の解析も含まれており多額の費用が必要であり、次年度以降は多くの研究費を繰り越している。