モデル生物を活用した先天性脳疾患関連オーファン糖転移酵素の機能解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670140
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 岡島 徹也 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20420383)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒坂 光 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90186536)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: O-GlcNAc / Dystroglycan / EOGT

Research Abstract

糖鎖修飾は、分泌過程で生じる翻訳後修飾の典型的なものであり、分泌タンパク質や膜表面タンパク質の大半は、何らかの糖鎖修飾を受ける。その中で、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）修飾は、ゴルジ体において起きると従来は考えられていた。しかしながら、我々は小胞体におけるGlcNAc修飾反応を世界に先駆けて見出した。最初の例は、Notch受容体のO-GlcNAc修飾であり、小胞体に局在するEOGTにより触媒される。興味深いことに、エキソーム解析によりEOGT-Lの遺伝子変異が脳異常を伴う先天性筋ジストロフィー（Walker-Warburg症候群）の患者に同定された。EOGT-Lに遺伝子変異を有する患者は、脳室の拡大（水頭症）と脳回の消失（滑脳症）といった脳奇形や眼球異常を認め、生後数週間以内に致死となる。これらの症状は、従来知られる典型的なWalker-Warburg症候群と同様に極めて重篤である。本年度の研究で我々は、EOGTのホモログであるEOGT-Lが、O-マンノシル化されたジストログリカン（DG）をGlcNAc修飾することを見出した。EOGT-LによるDGのGlcNAc修飾は、O-GlcNAc抗体として知られているCTD110.6により検出されることを見出した。さらに、CTD110.6抗体を用いた免疫染色により、EOGT-LによるDGのGlcNAc修飾が小胞体において生じることを見出した。これらの結果より、EOGTとEOGT-Lは小胞体局在のGlcNAc転移酵素であることが明らかになった。EOGTとEOGT-Lは、FringeやPomGnT1などのゴルジ体局在のGlcNAc転移酵素とはアミノ酸配列の上で類似性を示さないことから、構造的に新たな仕組みでGlcNAc転移反応を触媒する糖転移酵素ファミリーであると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

EOGT-Lの生化学的解析は終了し、機能解析に研究が進展している。

Strategy for Future Research Activity

Walker-Warburg症候群(WWS)やその主徴である滑脳症に関連するDystroglycanのGlcNAc修飾として、申請者らが報告したEOGT-Lによる小胞体GlcNAc修飾と、従来から知られるPomGnT1によるゴルジ体GlcNAc修飾がある。しかし、両者は、生化学的には独立した糖鎖修飾経路で作用するため、なぜ小胞体とゴルジ体のGlcNAc修飾が双方にDystroglycan機能に重要な役割を果たすかは、現段階では不明である。
この問題を解決するために、EOGT-L/PomGnT2とPomGnT1の２重欠損マウスを作製し、大脳皮質層構造の異常を解析する。PomGnT2による小胞体GlcNAc修飾がPomGnT1によるゴルジ体GlcNAc修飾の機能発現の必要条件となる可能性、または、小胞体GlcNAc修飾とゴルジ体GlcNAc修飾が重複的な機能を有する可能性を想定している。前者では、小胞体・ゴルジ体GlcNAc２重欠損マウスは小胞体GlcNAc欠損マウスと同等の表現型を示すが、後者では、２重欠損マウスは小胞体GlcNAc欠損マウスより重篤な表現型を示すと考えられる。なお、成体マウスでの解析には、Nestin-Cre; EOGT-L/PomGnT2 floxedマウスを使用する。
PomGnT2による小胞体GlcNAc修飾がPomGnT１によるゴルジ体GlcNAc修飾の機能に必要である場合、各変異体におけるDystroglycanの局在について、免疫組織染色により解析し、小胞体GlcNAc修飾がDystroglycanの小胞体からゴルジ体への輸送、又は、基底膜への局在に必要か検討する。一方、小胞体GlcNAc修飾とゴルジ体GlcNAc修飾が、独立してポストリン酸糖鎖伸長に関与し、重複的な役割を果たす場合は、PomGnT２のトランスジェニックマウスを作製し、PomGnT1変異体の表現型がrescueできるか検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

EOGT-Lのキメラマウスが不妊であるため、ヘテロマウスが現段階では得られておらず、一部の予定実験が、次年度に繰り越しになっている。
キメラマウスから精子を採取し、C57BL/6の卵子と受精させるICSIレスキュー実験を大阪大学と共同で実施する。

Research Products

• [Journal Article] GTDC2 modifies O-mannosylated α-dystroglycan in the endoplasmic reticulum to generate N-acetyl-glucosamine epitopes reactive with CTD110.6 antibody. (2013)
  • Author(s): Ogawa, M., Nakamura, N., Nakayama, Y., Kurosaka, A., Manya, H., Kanagawa, M., Endo, T., Furukawa, K., and Okajima, T.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 440 Pages: 88-93
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.09.022.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Post-weaning increases in the milk-fat globule EGF-factor VIII on fat globules in mouse milk and in the uptake of the fat globules by HC11 mammary epithelial cells. (2013)
  • Author(s): Nakatani, H., Yasueda, T., Oshima, K., Okajima, T., Nadano, D., Flint, D. J., and Matsuda, T.
  • Journal Title: J Biochem Volume: 153 Pages: 31-41
  • DOI: 10.1093/jb/mvs116.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Trimeric Tn Antigen on Syndecan 1 Produced by ppGalNAc-T13 Enhances Cancer Metastasis via a Complex Formation with Integrin alpha5beta1 and Matrix Metalloproteinase 9 (2013)
  • Author(s): Matsumoto, Y., Zhang, Q., Akita, K., Nakada, H., Hamamura, K., Tsuchida, A., Okajima, T., Furukawa, K., Urano, T., and Furukawa, K.
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 288 Pages: 24264-24276
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.455006.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dephosphorylation reduces passage of ovalbumin antigen through intestinal epithelial Caco-2 cell monolayers. (2013)
  • Author(s): Matsubara, T., Akiyama, Y., Oshima, K., Okajima, T., Nadano, D., and Matsuda, T.
  • Journal Title: J Biochem Volume: 153 Pages: 347-354
  • DOI: 10.1093/jb/mvs154.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Allergenic potential of rice-pollen proteins: expression, immuno-cross reactivity and IgE-binding. (2013)
  • Author(s): Hirano, K., Hino, S., Oshima, K., Okajima, T., Nadano, D., Urisu, A., Takaiwa, F., and Matsuda, T.
  • Journal Title: J Biochem Volume: 154 Pages: 195-205
  • DOI: 10.1093/jb/mvt044.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Biochemical and functional analysis of EOGT mutation associated with Adams-Oliver syndrome. (2014)
  • Author(s): Mitsutaka Ogawa, Pawel Bieniasz-Krzywiec, Takami Kawai, Yuta Sakaidani, Hirokazu Yagi, Koichi Kato, Koichi Furukawa, Tetsuya Okajima
  • Organizer: International Symposium on Glyco-Neuroscience
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台（淡路市）
  • Year and Date: 20140109-20140111
• [Presentation] Roles of O-glycosylation in Notch signaling pathway. International Symposium on Glyco-Neuroscience (2014)
  • Author(s): Tetsuya Okajima
  • Organizer: International Symposium on Glyco-Neuroscience
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台（淡路市）
  • Year and Date: 20140109-20140111
• [Presentation] EOGT の酵素化学的性質とアダムズ- オリバー症候群の関連性 (2013)
  • Author(s): 小川 光貴、河合 崇生、堺谷 祐太、矢木 宏和、加藤 晃一、古川 鋼一、岡島 徹也
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] EOGTの酵素化学的性質とアダムズ―オリバー症候群の関連性 (2013)
  • Author(s): 小川 光貴、堺谷 祐太、河合 崇生、矢木 宏和、加藤 晃一、古川 鋼一、岡島 徹也
  • Organizer: 第86回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（横浜市）
  • Year and Date: 20130911-20130913
• [Presentation] アダムズ-オリバー症候群に関わるEogt遺伝子変異の分子機構解析 (2013)
  • Author(s): 小川光貴、河合崇生、堺谷祐太、矢木宏和、加藤晃一、古川鋼一、岡島徹也
  • Organizer: 第32回日本糖質学会年会
  • Place of Presentation: 大阪国際交流センター（大阪市）
  • Year and Date: 20130805-20130807
• [Book] ST6 N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 5,6 (ST6GALNAC5,6) in “Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes” (Eds. Taniguchi, N., Honke, K., Fukuda, M., Narimatsu, H., Yamaguchi, Y., Angata, T.) (2013)
  • Author(s): Furukawa K, Okajima, T. Tsuchida A, and Furukawa, K.
  • Total Pages: 1707 (759-765)
  • Publisher: Springer
• [Book] ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 6 (ST3GAL6). in “Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes” (Eds. Taniguchi, N., Honke, K., Fukuda, M., Narimatsu, H., Yamaguchi, Y., Angata, T.) (2013)
  • Author(s): Okajima, T., and Furukawa, K.
  • Total Pages: 1706 (687-691)
  • Publisher: Springer