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2013 Fiscal Year Research-status Report

RNAアプタマーによる腫瘍マーカー検出法の開発

Research Project

Project/Area Number 25670151
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research

Research InstitutionNagoya City University

Principal Investigator

藤原 俊伸  名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (80362804)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords核酸医薬 / アプタマー
Research Abstract

スフィンゴシン1-リン酸(S1P)は生体膜構成成分スフィンゴ脂質の代謝産物であり、細胞表面に発現しているスフィンゴシン1-リン酸受容体(S1PR)と結合し、細胞遊走などの生理活性を発揮する。S1PRはGタンパク質共役型受容体(GPCR)であり、これまでに5つのサブタイプが同定され、それぞれ組織特異的に発現している。そして、近年S1PRがガンの悪性化に深く関わることが明らかになってきており、腫瘍マーカーとしての位置づけも重要となってきた。現在、受容体を標的とする腫瘍イメージングは、RI標識したリガンドおよびリガンドアナログを用いて行われている。また、抗腫瘍作用を有するリガンドの開発も盛んに行われている。しかしながら、従来の治療・診断用物質は、標的となる腫瘍細胞表面の受容体のみならず、正常細胞に発現している受容体とも交差反応するために、診断精度・治療上の安全性に問題が指摘されている。そのため、サブタイプ特異的作動薬および診断薬の開発が期待されている。そこで、S1PRの各サブタイプと特異的に結合できる人工リガンドを「RNA」という高分子マテリアルを利用し、創製することを試みている。
本年度はヒトS1PRを標的とするRNAアプタマーを、SELEX法で創製するために必要な組換えタンパク質およびS1PR発現細胞の作成に取りかかった。具体的にはS1PRのうち、細胞表面に出ているペプチド部分について各S1PRのサブタイプについて大腸菌を用いた組換えタンパク質として調製した。
一方で、S1PRを発現していないCHO-K1 細胞にレンチウィルス発現系を用いてS1PRの各サブタイプを恒常的に発現するstable cell lineを構築し、この細胞を用いたCell-base SELEXを実施を開始した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

S1PRは悪性脳腫瘍由来細胞よりクローニングを図ったのだが、全てのサブタイプをクローニングするのに少し時間を要した。一方で当所困難が予想された組換えタンパク質の調製が順調に進んだ。さらに、CHO-K1 細胞にレンチウィルス発現系を用いてS1PRの各サブタイプを恒常的に発現するstable cell line構築を進めている。また、予備実験として同システムを用いてSSTR、TGF-β type III受容体の細胞表面へ恒常的に発現させる系を構築しており、これらの系を用いてRNAアプタマーの取得を行っている。
以上のような理由によりおおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

まずS1PRに対する結合性を基盤にRNAアプタマーをスクリーニングする。S1PRのうち細胞表面に発現しているペプチド部の組換え体を用いて結合性を指標としたアプタマーの創製を進める。さらに、創製したS1PR発現CHO-K1 細胞が機能的に発現しているかどうかをFDSSを用いて確認する。確認後、Whole cell selexを実施する。

  • Research Products

    (17 results)

All 2014 2013

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 5 results) Presentation (11 results)

  • [Journal Article] Structural insights into the recruitment of SMRT by the corepressor SHARP under phosphorylative regulation.2014

    • Author(s)
      Mikami S, Kanaba T, Takizawa N, Kobayashi A, Maesaki R, Fujiwara T, Ito Y, Mishima M.
    • Journal Title

      Structure

      Volume: 7 Pages: 35-46

    • DOI

      10.1016/j.str.2013.10.007.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Microbial fluorescence sensing for human neurotensin receptor type 1 using Gα-engineered yeast cells.2014

    • Author(s)
      Ishii J, Oda A, Togawa S, Fukao A, Fujiwara T, Ogino C, Kondo A.
    • Journal Title

      Anal Biochem

      Volume: 446 Pages: 37-43

    • DOI

      10.1016/j.ab.2013.10.016

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The essential role for the RNA triphosphatase Cet1p in nuclear import of the mRNA capping enzyme Cet1p-Ceg1p complex of Saccharomyces cerevisiae.2013

    • Author(s)
      Takizawa N, Fujiwara T, Yamasaki M, Saito A, Fukao A, Nomoto A, Mizumoto K.
    • Journal Title

      PLoS One

      Volume: 8 Pages: e78000

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0078000.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Targeting cancer cell-specific RNA interference by siRNA delivery using a complex carrier of affibody-displaying bio-nanocapsules and liposomes.2013

    • Author(s)
      Nishimura Y, Mieda H, Ishii J, Ogino C, Fujiwara T, Kondo A.
    • Journal Title

      J Nanobiotechnology

      Volume: 11 Pages: 19

    • DOI

      10.1186/1477-3155-11-19.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structure of the second RRM domain of Nrd1, a fission yeast MAPK target RNA binding protein, and implication for its RNA recognition and regulation.2013

    • Author(s)
      Kobayashi A, Kanaba T, Satoh R, Fujiwara T, Ito Y, Sugiura R, Mishima M.
    • Journal Title

      Biochem Biophys Res Commun.

      Volume: 437 Pages: 12-17

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2013.06.008.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Staphylococcal superantigen-like protein 10 (SSL10) inhibits blood coagulation by binding to prothrombin and factor Xa via their γ-carboxyglutamic acid (Gla) domain.2013

    • Author(s)
      Itoh S, Yokoyama R, Kamoshida G, Fujiwara T, Okada H, Takii T, Tsuji T, Fujii S, Hashizume H, Onozaki K.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 288 Pages: 21569-21580

    • DOI

      10.1074/jbc.M113.451419.

  • [Presentation] Analyses of cell type specific translation from the IRES mRNA derived from two different Poliovirus strains2014

    • Author(s)
      貞廣暁利、藤原俊伸
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] Dissecting roles of Paip1 in HuD mediated translation activation2014

    • Author(s)
      青山智彦、藤原俊伸
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] Effect of eIF4B phosphorylation by active Akt1 recruited into cap binding complex by HuD on translation2014

    • Author(s)
      矢野雄暉、藤原俊伸
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] 高辻良文、藤原俊伸2014

    • Author(s)
      Translational regulation by HuD through the interaction with eIF3
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] Functional relationship between HuD and Paip2 in differentiation of PC12 cells2014

    • Author(s)
      大塚衆志、藤原俊伸
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] Novel cell free translation system using human cultured cell lines2014

    • Author(s)
      深尾亜喜良、藤原俊伸
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] In vitro selection of RNA aptamer to SSTRs2014

    • Author(s)
      山田由佳、藤原俊伸
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] High-throughput screening approach combining siRNA reverse-transfection and reporter mRNA transfection2014

    • Author(s)
      藤原俊伸
    • Organizer
      第 8 回 「 長野ミーティング :生物資源の有効利用を目指して」
    • Place of Presentation
      長野
    • Year and Date
      20140302-20140304
  • [Presentation] The RNA-binding protein HuD regulates cap-dependent translation by binding to the mRNA nuclear export receptor TAP/NXF12013

    • Author(s)
      Ryosuke Satoh, Akira Fukao, Akio Nomoto and Toshinobu Fujiwara
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] HuD accelerates cap-dependent translation through eIF4B phosphorylation by active Akt12013

    • Author(s)
      Yuki Yano, Akira Fukao and Toshinobu Fujiwara
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] The mechanism of translational control which targets a translation initiation complexa2013

    • Author(s)
      Akira Fukao, Nahum Sonenberg, Christian Thoma and Toshinobu Fujiwara
    • Organizer
      2013 RiboClub Annual Meeting
    • Place of Presentation
      ケベック
    • Year and Date
      20130923-20130925

URL: 

Published: 2015-05-28  

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