2013 Fiscal Year Research-status Report
日本近縁ヒト集団間で異なる新規分散型繰り返し領域の探索とその集団の推定法の確立
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25670342
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
山本 敏充 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50260592)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 法医学 / ヒト集団遺伝学 / 人類学 / ゲノム科学 / 遺伝的異質性 |
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| Research Abstract |
初年度の本年度の計画としては、非連結・既収集試料を用いたゲノム解析研究として、名古屋大学医学部倫理委員会に申請し、承認を得る予定であったが、今回用いるトランスポゾンディスプレイ法の習得をし、本研究が実現可能であるかどうかを見極めてから、申請することとした。それで、最初に、ヒトAlu配列のうち、文献やNCBIなどのデータベースからこれまでにAlu配列であると考えられている部位の配列を検索した。検索されたAlu配列のコンセンサスな部分を、中でも比較的若い配列であるといわれているAluY配列のコンセンサスな部分を切断しない制限酵素としてMspIを選択した。制限酵素Msp Iを用いて、トランスポゾンディスプレイ法に従い、研究代表者らのDNA試料を断片化した。
アダプター付加反応により、DNA断片の両端にアダプターを結合した。アダプタープライマー（AATAGGGCTCGAGCGGCと配列決定）及びAlu特異的プライマー（CACTGCAACCTGCGCCTCと配列決定）により１回目のPCR増幅を行った。入れ子になるアダプタープライマー（CGGCAGCTATTAATAGTACCと配列決定）及びAlu特異的プライマー（CACTGCAACCTGCGCCTC）により２回目のPCR増幅を行った。各増幅産物を１枚のポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、銀染色法によりバンドを検出した。本年度は、特異的プライマー及び１回目と２回目のアニーリング温度の検討を行った結果、おおよその条件が決定し、本目的のためのトランスポゾンディスプレイ法をほぼ確立することができた。
これらの結果から、方法論としての技術が習得できたので、今後、非連結・匿名化した日本人及び韓国人のDNA試料を使用し、本法を応用するゲノム解析研究として、名古屋大学医学部倫理委員会に申請するための準備をした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の計画の中では、最初に、本研究を非連結・既収集試料を用いたゲノム解析研究として、名古屋大学医学部倫理委員会に申請し、承認を得る予定であったが、今までに経験のない方法であったトランスポゾンディスプレイ法を確立してからの方が委員会での承認を得やすいと考えたので、研究代表者らのDNAを使用してその方法の確立に奮闘した。中でも、アダプター付加反応は、アダプターが付加しているかどうか、最終的に二度のPCR反応の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動－エチジウムブロマイド染色の後にわかるので、この部分におおよその時間を割いてしまった。また、特異的になるようなプライマーの設計、およびそのPCR条件を決定するのも、細かい条件設定であるため、時間を多く費やしてしまった。その結果、この研究で一番ネックになっている部分を、約１年をかけてほぼ確立することができたので、今後の研究の難易度を考え、全体的な進捗状況を考えると、やや遅れているようにも見えるが、おおむね順調に進展しているのではないかと考えられる。
一方、そのやや遅れているように感じられる部分を補うべく、既に倫理委員会への申請書類もほぼ準備ができており、さらに、韓国人試料が不足する場合のことも勘案し、ソウル国立大学医学部法医学教室の李崇徳教授との間で、昨年の９月にメルボルンで開催された第25回国際法医遺伝学会においてのディスカッションで協力関係の約束も得られている。
このように、本研究で一番課題となる技術的な部分はほぼクリアし、さらにこのようなゲノム研究で重要なDNA試料についても、本研究を完成させるためには、本研究室だけでの既収集試料で不十分な場合に備えての準備は着々とされてきた。従って、多少進行の順番が異なるところがあり、やや遅延しているようにも見受けられるが、今後の経験のある実験操作や既収集試料の使用を考慮すると、ほぼ順調であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度準備した名古屋大学医学部倫理委員会への申請を、非連結・匿名化した日本人及び韓国人のDNA試料を使用し、本法を応用するゲノム解析研究として行う。
昨年度習得したMspIを用いたトランスポゾンディスプレイ法を利用して、日本人及び韓国人各24名の試料を用いて、ゲルイメージの中から、日本人と韓国人とで異なるバンドを見つけ出す。既収集試料の韓国人試料が不足する場合は、親交の深いソウル国立大学医学部法医学教室の李崇徳教授に協力を依頼し、共同研究として行う。また、異なるバンドが数個程度しか見つからなかった場合は、さらに２つほど制限酵素追加して、それぞれのトランスポゾンディスプレイ法の条件を決定し、日本人と韓国人で異なるバンドをさらに探索する。
特異性の高いバンドを約20種類ほど選択し、各バンドを切り出した後、M13を付加したプライマーにより、PCR増幅を行う。その後、M13プライマーによるターミネータ法により直接塩基配列を決定し、各Alu配列の近傍領域の共通な固有塩基配列から、ヒトゲノム上での局在をデータベースから検索し、ゲノム上での局在及びその周辺領域の塩基配列情報を得る。
データベースから得られた位置情報及び塩基配列から、再度近傍の約1 kbの塩基配列を決定し、Alu配列の有無を確認する。全てのマーカーの増幅産物が約200 bp以下になるように、また同じ大きさにならないようにプライマー設計する。
これらのプライマーを用いて、選択されたAlu約20マーカーについて、さらに多くの韓国人（96名）及び日本人（秋田、名古屋及び大分の各96名）のサンプルを利用して、その特異性について検討する。
他のアジア人集団として、５地域の中国人、５地域のモンゴル人、ミャンマー、タイなどの各ヒト集団から24サンプル、並びにアフリカ系及びヨーロッパ系のヒト集団24サンプルについても特異性を検討する。
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