2013 Fiscal Year Research-status Report

抗体エフェクター機能におけるIgG脱糖鎖化を起こす脂溶性因子の作用機序

Research Project

Project/Area Number	25670456
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	Akita University
Principal Investigator	増田豊秋田大学, 医学部, 講師 (20199706)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords	アナフィラキシー / IgG / 糖鎖
Research Abstract	本研究の目的は、繰り返し免疫するときに血中に増加する脂溶性因子がIgG抗原特有なアナフィラキシーを抑制する機構を解明し、抗体エフェクター機能における糖鎖部分の構造変化との関連を明らかにすることである。これまでに、生体内(in vivo)でIgG機能を制御する未知の液性脂溶性因子を発見し、本脂溶性因子に存在する糖鎖がIgGにより惹起されるアナフィラキシーに重要であることを見出した。マウスに卵白アルブミン（OVA）を繰り返し注射し免疫すると、アナフィラキシーを起こす個体が見られるが、血清中の抗OVA抗体IgGを精製し、Fc領域の糖鎖を除去したIgGをマウスに静注しておくと、OVAを再度注射すると引き起こされるアナフィラキシーショックが顕著に抑制されることを見出した（Guo et al., Biomed. Res., 2003）。また、このときのマウス血中の抗OVA抗体IgGに付加する糖鎖へのフコース付加が特異的に増加してくることを見出した（Guo et al., Clin. BiocChem., 2005）。フコース付加は抗体のエフェクター機能を抑制することが知られており、抗OVA抗体IgGの細胞傷害活性（ADCC活性）を低下させると考えられる。さらに、繰り返し免疫で血中に増加する脂溶性因子を含む画分を精製し、OVAと同時にマウスに静注するとアナフィラキシーショックが顕著に抑制されることを見出した。繰り返し免疫していないマウスから同様の分離操作で得た脂溶性画分にはそのような効果が認められないことから、繰り返し免疫の前後の脂溶性画分を分析したところ脂溶性画分は糖鎖を含みその糖鎖構造が繰り返し免疫の前後で変化していることがわかった。繰り返し免疫で血中に増加する脂溶性因子の糖鎖変化がIgGの関与するアナフィラキシーに関係していると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason マウスにOVAを繰り返し免疫し、血清を採取して脂溶性因子の精製と解析を行った。血清をクロロホルム／メタノールで抽出し、DEAEカラムクロマトグラフィーにより分画した。250-300mM NaCl溶出画分にアナフィラキシー抑制効果の最も高い因子が溶出していることが明らかになった。この画分についてレクチンを使ってELISA分析したところ、脂溶性因子を含む画分は糖鎖付加していること、さらに、繰り返し免疫をする前のマウスの血清から精製した画分と比較すると、フコース含有糖鎖に反応するAALレクチンへの反応性が低下していることがわかった。このことから繰り返し免疫前の脂溶性画分は糖鎖構造にフコースを含んでいて、繰り返し免疫をするとその糖鎖構造が変化すると考えられた。また、限外濾過膜を使って脂溶性因子の分子サイズを分析したところ、見かけの分子量は３０kDa以上であることから、脂溶性因子は脂質がミセル構造をとっている可能性が考えられた。
Strategy for Future Research Activity	これまでの解析結果から脂溶性因子を含む画分には糖脂質が存在する可能性が考えられるのでその分析を進める。糖鎖構造を解析するために、糖鎖分解酵素処理とレクチンELISA分析を組み合わせて解析を行う。また、薄層クロマトグラフィーや質量分析装置による分析を行い脂溶性因子の構造を解明する。また、繰り返し免疫前後の脂溶性因子の糖鎖構造変化とアナフィラキシーショック抑制活性の相関を調べるため、脂溶性因子を含む画分に糖分解酵素処理など行い活性への影響を確認する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	２５年度は計画していた抗OVA抗体IgGの糖鎖構造解析を行う予定であったが、前倒しで血清の脂溶性画分の解析も平行して行なったところ、アナフィラキシー抑制活性を示す脂溶性因子の構造の解明に有用な結果が得られてきたのでその分析を重点的に行った。そのため、IgG糖鎖構造解析に使用予定の試薬の購入が予定より少ない。２６年度は計画通り血中脂溶性因子の分析を行い、その後必要に応じてIgG糖鎖構造解析も行う。そのため交付申請書に記載した研究費と次年度使用額を合わせて使用する。脂溶性因子の構造解析を進め、糖脂質である場合はその糖鎖構造の変化と活性との相関を解析する。このための試薬物品費、分析機器費、共通機器使用費、研究補助事業者の人件費、また、成果発表のための学会参加の旅費などを研究費として予定する。