MyoD転写活性化ドメインを付加したRunx2による骨芽細胞への分化転換機構

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670784
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 二藤 彰 鶴見大学, 歯学部, 教授 (00240747)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒木 良子 独立行政法人放射線医学総合研究所, 研究基盤センター, 室長 (40392211) ; 中島 和久 鶴見大学, 歯学部, 非常勤講師 (90252692) ; 出野 尚 鶴見大学, 歯学部, 実習指導教員 (40435699)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 分化転換 / 転写活性 / MyoD

Research Abstract

分化転換モデルとしては　Osx-cre-GFP miceを用いた。これはthe osterix (Sp7) promoterの直下にtTA tetracycline transactivatorがあり、その直下にtetracycline responsive element (TRE; tetO)-controlled GFP/Cre fusion protein　が存在する。tetracycline analog doxycycline　の非存在下では、Osx1が発現している細胞でオンになっており、ＧＦＰもプラスになる。そこでOsx陰性細胞が、陽性細胞になった状態を骨芽細胞形質を獲得したとの指標とできる可能性があるため、予備的検討としてOsx-cre-GFP mice由来の皮膚線維芽細胞を培養し、ＧＦＰの状態とOsxの発現状態を調べた。定常状態ではほとんどＧＦＰは発現していないが、ＢＭＰ処理することにより、ＧＦＰが発現することを確認した。内在性の遺伝子発現を調べて見たところ、Osx、Id-1,ALP　の遺伝子発現が上昇しており、分化誘導が非骨芽細胞においてもモニターできることを確認できた。次に骨軟骨分化に関与する重要な転写因子Osterix runx2 sox9　についてそれぞれTAD fusion タンパクを作成しその機能を解析した。MyoD-runx2 についてはrunx2　binding site を持つosteocalcin プロモーターのOG-2 Lucに対しての転写活性化能、 MyoD-sox9についてはtype II collagen promoter sox9 binding site を持つ　coll2 sox9BD-Lucに対しての転写活性化能を指標とした。前者についてはMyoD fusionをつけたものが、付けないものに対して20倍以上転写活性化が見られた。後者についてはその差は10倍程度であるが、興味深いことに、2コピーのMyoD-TAD fusionと1コピーのものと比べると前者のほうが若干低く、至適な量が存在する可能性が示された。またMyoD-Osterixについては　10T1/2細胞に発現させたとき、コラーゲンI型遺伝子の発現はMyoD fusionをつけたものが、付けないものに対して10倍以上発現を促進させた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究においてmyoD-TAD-fusionを発現させることで有効に転写活性化能をあげるのは、２つの転写因子runx2 sox9で示された。Osterixについては転写活性化を測定する上でのターゲットとなる配列が不明確であるため、正確に転写活性化能を評価することは難しい。しかしながら内在性の遺伝子発現に及ぼす影響はコントロールに比べはるかに上昇させており、少なくとも転写因子としての機能は高まっていることが示された。またTADコピー数が高まればその効果が増加するものである、ということではなくむしろ至適な量（あるいは位置）がある事が示された。また分化転換モデルとしてのOsx-cre-GFP mice由来の皮膚線維芽細胞もosterixがオンになっている状態を評価できる、という点で一定のモデルとなり得ることが示された。この皮膚由来の細胞を効率よく骨芽細胞系譜へ分化させることができるか、が次年度への課題である。

Strategy for Future Research Activity

myoD-TAD　fusionの転写活性化メカニズムの解析
myoD-TAD　fusionによって少なくとも骨格系に関わる重要な転写因子の３つとも機能が活性化されていることが前年度の結果から示唆された。そこで今年度はどのようなメカニズムによって転写活性化が起こるか、次のアプローチで明らかにする。１）TADのどこが特に重要であるか、調べるためにTAD deletion mutant を作成し、それぞれの活性化能を比較する。２）転写活性化に関わる候補としてHAT活性のある分子（p300など）が考えられる。そこでそれらのノックダウンをすることで活性化能にどのような影響があるか、調べる。３）２）で影響が得られた分子についてはTADドメインとの直接の作用があるか否かをIPによって調べる。４）fusionをリンカータイプのもの（たとえばglycin linker）に変えたときにその活性がどのように影響があるかを調べる。
myoD-TAD　fusionの骨芽細胞系譜へ分化転換能の解析
前年度に引き続き皮膚由来の細胞を効率よく骨芽細胞系譜へ分化させる条件を検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

２５年度には一時的な研究補助のための人件費を計上していたが、進行上また試薬の進歩により効率よく研究を行うことができる部分があり、必ずしもその研究補助は必要が無くなったが、一方でそのために高額な試薬を購入する必要が生じた（物品費）。そのため、予定より物品費がかかった。しかしながらトータルでは、次年度使用額が生じた。
高価な試薬を当初の想定より多く購入する必要があること、また輸入試薬であり、外国為替の影響で価格の値上げが予定されており、次年度には物品費が予定より多く必要であると思われる。したがってこの使用額を次年度の使用予定額に加えてトータルでの物品費増加に充当させる。

Research Products

• [Journal Article] Efficient expansion of mouse primary tenocytes using a novel collagen gel culture method. (2014)
  • Author(s): Shimada A, Wada S, Inoue K, Ideno H, Kamiunten T, Komatsu K, Kudo A, Nakamura Y, Sato T, Nakashima K, Nifuji A.
  • Journal Title: Histochemistry and Cell Biology Volume: 141 Pages: in press
  • DOI: DOI 10.1007/s00418-014-1191-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Predominant expression of H3K9 methyltransferases in prehypertrophic and hypertrophic chondrocytes during mouse growth plate cartilage development. (2013)
  • Author(s): Ideno H, Shimada A, Imaizumi K, Kimura H, Abe M, Nakashima K, Nifuji A.
  • Journal Title: Gene Expression Patterns Volume: 13 Pages: 84-90
  • DOI: doi: 10.1016/j.gep.2013.01.002.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Alendronate promotes bone formation by inhibiting protein prenylation in osteoblasts in rat tooth replantation model. (2013)
  • Author(s): Komatsu K, Shimada A, Shibata T, Wada S, Ideno H, Nakashima K, Amizuka N, Noda M, Nifuji A.
  • Journal Title: J Endocrinology Volume: 219 Pages: 145-158
  • DOI: doi: 10.1530/JOE-13-0040
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Negligible immunogenicity of terminally differentiated cells derived from induced pluripotent or embryonic stem cells. (2013)
  • Author(s): Araki R, Uda M, Hoki Y, Sunayama M, Nakamura M, Ando S, Sugiura M, Ideno H, Shimada A, Nifuji A, Abe M.
  • Journal Title: Nature. Volume: 494 Pages: 100-104
  • DOI: doi: 10.1038/nature11807
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular mechanisms of skeletal tissue formation. (2013)
  • Author(s): Nifuji A
  • Journal Title: J Physical Fitness and Sports Medicine Volume: 2 Pages: 1-8
  • DOI: doi:10.7600/jpfsm.2.1
  • Peer Reviewed
• [Presentation] MyoD mediated myogenic conversion from fibroblasts into myoblasts is blocked by cell cycle inhibition (2013)
  • Author(s): Hisashi Ideno, Kazuhisa Nakashima, Yasuyuki Ohkawa, Hiroshi Kimura , Ryoko Araki , Masumi Abe , Akira Nifuji
  • Organizer: 第３６回 日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 兵庫県
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] Histone 3 lysine 9 methyltransferases , G9a, GLP, SUV39h1, and PRDM2, are expresssed during mouse tooth development. (2013)
  • Author(s): Kamiunten T, Ideno H, Shimada A, Nakamura Y, Nakashima K, Kimura H, Nifuji A
  • Organizer: 第３６回 日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 兵庫県
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] Regulations of osteoblastic survival at entheses. (2013)
  • Author(s): Wada S, Shimada A, Ideno H, Nakamura Y, Nakashima K, Nifuji A
  • Organizer: 第３６回 日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 兵庫県
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 発生の骨格組織分化におけるH3K9メチル化酵素群の発現局在 (2013)
  • Author(s): 二藤彰、 島田明美、 中島和久
  • Organizer: 第55回歯科基礎医学会学術大会
  • Place of Presentation: 岡山コンベンションセンター 岡山県
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] Predominant expression of Histone 3 lysine 9 methyltransferases in the prehypertrophc chondrocytes during the growth plate chondrocyte development (2013)
  • Author(s): Ideno H, Shimada A, Kamiunten T, Imaizumi, K, Nakashima K, Nifuji A
  • Organizer: 2nd Joint Meeting of the International Bone and Mineral Society and The Japanese Society for Bone and Mineral Research
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 兵庫県
  • Year and Date: 20130528-20130601
• [Presentation] Three histone 3 lysine 9 methyltransferases , G9a, GLP, and SETDB1, are expresssed during mouse tooth development. (2013)
  • Author(s): Kamiunten T, Shimada A, Ideno H, , Nakashima K, Nakamura Y, Nifuji A
  • Organizer: 2nd Joint Meeting of the International Bone and Mineral Society and The Japanese Society for Bone and Mineral Research
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 兵庫県
  • Year and Date: 20130528-20130601
• [Presentation] Tenocytes regulate cell survical of osteoblasts in vitro. (2013)
  • Author(s): Wada S, Shimada A, Ideno H, Nakamura Y, Nakashima K, Nifuji A
  • Organizer: 2nd Joint Meeting of the International Bone and Mineral Society and The Japanese Society for Bone and Mineral Research
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 兵庫県
  • Year and Date: 20130528-20130601
• [Presentation] Endocytic incorporation of alendronate promotes bone formation (2013)
  • Author(s): Komatsu K, Shimada A, Ideno H, Shibata T, Nakashima K, Amizuka N, Noda M, Nifuji A
  • Organizer: 2nd Joint Meeting of the International Bone and Mineral Society and The Japanese Society for Bone and Mineral Research
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 兵庫県
  • Year and Date: 20130528-20130601