2013 Fiscal Year Research-status Report

健忘作用獲得のための新しい精神鎮静法の確立

Research Project

Project/Area Number	25670858
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	富岡重正徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (70188770)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宮脇卓也岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (00219825)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	健忘作用 / シナプス外GABA受容体
Research Abstract	健忘作用に強く関与すると言われているα5サブユニットを含有するGABAA受容体をアフリカツメガエル卵母細胞膜上に発現させ、各種麻酔薬のα5GABAA受容体に対する作用を電気生理学的手法（voltage clamp法）を用いて検討するための準備をおこなった。これまで我々は、voltage clamp法を用いて得られたデータをアナログでペンレコーダーに記録させ、記録紙の波形データを手作業にて計測解析を行ってきた。本研究では、データ解析をより精密なものにするため、現有のアンプ（Warner社製 OC-725C）にPowerLabを接続し得られたアナログデータを、新たに購入したソフトウエアLabChartを用いてデジタル化し解析できるように設定した。一方、GABAA受容体を構成するサブユニットのcDNAは当初依頼した施設から得ることができず、最終的にデンマークのコペンハーゲン大学から11種類のサブユニットプラスミドDNA（α1-6, β1-3, γ2s, δ）を入手できた。現在、これらプラスミドDNAからcRNA作成の実験を急いでいる。つまり、プラスミドDNAをcompetent cellにtransformationさせた後、それぞれのベクターの耐性抗生物質が入ったプレートで培養し、得られたコロニーからplasmid DNAを精製した後シークエンスを行い確認する。これらプラスミドDNAに問題がなければ、プラスミドDNAからin vitroでcRNAを作成する。その後、それぞれのサブユニットcRNAを組み合わせアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションし、voltage clamp法を用いてデータを獲得し解析を行う予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 予定していたGABAA受容体サブユニットプラスミドDNAの入手が遅れたことが原因である。複数の海外施設にGABAA受容体を構成する11種類のサブユニットプラスミドDNAを依頼したが送付を拒否されたためである。
Strategy for Future Research Activity	今回使用するプラスミドDNAは11種類と多いためcRNAを作成するまでに多くの時間を要することが予想されるため、入手したプラスミドDNAからcRNA作成する分子生物実験を急ぐ必要があると考えている。電気生理学的手法についての準備はすでに整っているので、作成したcRNAに問題さえなければデータ取得までの時間はそれほどかからないと考えている。もしアフリカツメガエル卵母細胞への各種GABA受容体蛋白の発現に問題が生じた場合には、他施設に新たにプラスミドDNAの手配ができるよう準備を怠らないようにしたいと考えている。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	プラスミドDNAからcRNA作成までの分子生物実験には様々な試薬（制限酵素など）を必要とするが、DNAがどのようなベクターに入っているかなどの情報によって購入する試薬は異なってくる。プラスミドDNAの入手が遅れベクターなどの情報がなく試薬の購入ができなかったため、次年度使用額が生じた。今年度は、cRNA作成までに必要な試薬類、制限酵素、シークエンス費などに多くの予算を使用する予定である。さらにデータを取得するために必要な麻酔薬、GABA作動薬、GABA拮抗薬などの試薬も購入する予定である。