2013 Fiscal Year Annual Research Report
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25701005
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
塩谷 文章 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 特任助教 (10627665)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNA damage / ATR |
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| Research Abstract |
真核生物のゲノムDNA は継続的に内的及び外的要因によって損傷の危機にさらされている。これらのDNA 損傷による脅威に対抗するため、真核生物はDNA 損傷応答により細胞周期、DNA 複製、DNA 修復、アポトーシス及び細胞老化等を制御する。ATMやATR はDDR の最上流において主要な役割を果たすキナーゼである。ATMとATR は主にSQ/TQ 配列を標的としてリン酸化するなど、生化学的及び機能的に非常に良く似た性質を示すことが知られている。しかし、ATR は外的DNA 損傷非存在下であっても細胞増殖に必須であることに対してATMは必須ではない。そこで本研究ではATRの抜本的な機能解析を遂行するためAnalog-Sensitive kinase (AS-kinase)法を用いた特異的リン酸化基質の網羅的解析を目的とする。これまで数種類のAS-ATR候補の 作成に成功している。野生型 ATP存在下におけるRad17 (Ser645)を基質として用いた評価において、WT-ATRに比べてAS-ATRは弱いキナーゼ活性を示す事が明らかとなった。またWT－ATRは数種類のATPアナログを用いた際に,野生型ATP使用時にくらべて弱いながらも活性を示す事が認められた。現在ATRキナーゼドメインに更なる変異を導入、及びATP アナログのスクリーニングをあわせて行い野生型では活性を示さずAS-ATR でのみキナーゼ活性を示すAS-ATR とATP アナログの組み合わせの選定を進めている。
この他に、AS-ATR を安定的に発現する様々な細胞を樹立するため、内在性のATRをコンディショナルにノックダウンするテトラサイクリン誘導性のshATR発現システム、及び、選定されたAS-ATRをテトラサイクリン誘導性に発現するシステムを掛け合わせ、テトラサイクリンによって内在性のATRとAS-ATRが入れ替わるシステムの構築も進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、新規AS-ATRの候補の作成に成功し、評価も順調に進んでいる。得られた結果は当初の予想に反するものもあるが、代替えする研究も進めており、当初の予定通り研究を遂行しうる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ATP アナログ感受性AS-ATR を作成しその安定発現細胞を樹立する。次にこれらの細胞から細胞抽出液を作成し、合成DNA とヒト細胞抽出液を用いたDNA-based In vitro checkpoint assay を用いてATRの活性化を既知のATR特異的基質を対象にATPアナログ存在下において評価する。さらにAS-ATR安定発現細胞を用いてDNA損傷存在下におけるATRによるリン酸化を解析し外的DNA損傷に応答するATRの機能解析を進める。また、外的DNA損傷非存在下において正常細胞とがん細胞におけるATRの基質のリン酸化を解析し、ゲノム不安定性を許容するATRの機能についても解析を進める予定である。さらには、DNA-based In vitro checkpoint assay を用いてATR の選択的阻害剤VE-821 を使用する事によりATR による基質のリン酸化を優位に検出する方法を用いてATRの特異的基質の同定に役立てる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
H25年度に、AS-ATRの候補の作成・解析を行い、その結果を基にATRの基質解析を行う予定であったが、作成したAS-ATRの結果が当初の予想に反したため、計画を変更し更なるAS-ATRの候補の作成をを行うこととした。このため、ATRの基質解析を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとした。
H26 年度には新たなAS-ATR候補の作成及び評価を行う。さらにLC-MS/MS によるを複数回予定しており、H25年度未使用の費用をこれらの解析費用にあてる。
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