2014 Fiscal Year Annual Research Report
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25701005
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
塩谷 文章 独立行政法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (10627665)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNA damage / ATR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷応答はDNA損傷を検出・認識し、シグナルへ変換することにより誘発される。ATMやATRはDNA損傷応答を最上流で制御するキナーゼでありATMはDNA二本鎖切断(DSB)に応答するのに対してATRはDNA複製ストレスを始めほぼすべてのDNA損傷によって生ずる一本鎖DNA(ssDNA)に応答する。ssDNA領域はDNA複製の進行に伴って二次的なDSBを生ずることや、DSBはその修復過程におけるDNAの削り込み（DSB resection）によりssDNAを生ずることから、ATMとATRは協調的に働くことによりゲノムの安定性を維持している事を示唆している。ATMとATRは生化学・機能的に良く似た性質を示すと考えられているが、ATRは細胞増殖に必須であることに対してATMは必須ではない。そこで本研究ではATRの抜本的な機能解析を遂行するためAnalog-Sensitive kinase (AS-kinase)法を用いた特異的リン酸化基質の網羅的解析を目的とする。これまでに数種AS-ATR候補の 作成に成功している。野生型 ATP存在下におけるRad17 (Ser645)を基質として用いた評価において、WT-ATRと同様に活性を示すAS-ATR候補は少なく、その多くは活性を失う事が明らかとなった。またWT－ATRは数種類のATPアナログを用いた際に,野生型ATP使用時にくらべて弱いながらも活性を示す事が認められた。現在ATRキナーゼドメインに更なる変異を導入、及びATP アナログのスクリーニングをあわせて行い野生型ATP使用時と同様の活性を示すAS-ATR とATP アナログの組み合わせの選定を進めている。この他に、ATR特異的な基質を調べる対象としてATR阻害剤（VE821）に対する細胞毒性試験を行い、感受性として数十倍異なる細胞株を選定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者が研究施設を異動したため、研究施設の整備に時間を費やした。
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| Strategy for Future Research Activity |
ATP アナログ感受性AS-ATR を作成しその安定発現細胞を樹立する。次にこれらの細胞から細胞抽出液を作成し、合成DNA とヒト細胞抽出液を用いたDNA-based In vitro checkpoint assay を用いてATRを活性化させ、既知のATR特異的基質を対象にAS-ATRがDNA損傷に応答しATPアナログを利用しうるかを評価する。さらにAS-ATR安定発現細胞を用いて細胞におけるATRによるリン酸化を解析しATRの機能解析を進める。同定された基質についてパスウェイ解析を行いATRによる新規制御機構について検討する。さらに同定された新規基質をノックダウンすることやリン酸化部位に変異を導入することによりATRによる新規基質のリン酸化がゲノムの安定性維持機構に及ぼす影響について解析する。さらに、AS-ATRの作成が困難な場合には、DNA-based In vitro checkpoint assay を用いてATRを選択的な活性化、およびATR阻害剤VE-821 を使用する事によりATR による基質のリン酸化を優位に検出、これに加えてγ-S-ATPを用いて新規リン酸化部位を標識するする方法を用いてATRの特異的基質の同定に役立てる。
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| Causes of Carryover |
H２６年度に研究代表者の所属が変わり、研究室の立ち上げに時間を要したため、H26年度にAS-ATRの候補作成解析を行って、AS－ATRを確定したのち、ATRの基質解析を行う予定であったが、AS－ATRの候補が活性を示さないことなどから、再作成を余儀なくされ、計画を変更しさらなるAS-ATRの候補を作成を行っている。このためATRの基質解析を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H27年度には新なAS-ATR候補の作成及び評価を行う。またAS-ATRが作成できない場合にはin vitro ATR活性化システムを用いて新規基質の同定を行う。解析にはLC-MS/MSを予定しておりH26年度に未使用の経費を解析費用に充てる。
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