2013 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリア病としての細網異形成症の分子機序の解明と新規栄養療法の考案
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25750042
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
谷村 綾子 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (10610199)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | アデニンヌクレオチド代謝 / AK2 / CKMT / ミトコンドリア / 血球系分化 / 細網異形成症 / 好中球 |
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| Research Abstract |
細網異形成症(RD)は重症複合型免疫不全症の亜型であり、致死的な感染症を起こす。近年、原因遺伝子としてエネルギー代謝酵素アデニル酸キナーゼ2(AK2)が報告された。AK2はATPとADPを相互変換し、ミトコンドリア膜間におけるATP濃度の恒常性を維持している。しかし、ミトコンドリア膜間ではミトコンドリアクレアチンキナーゼ (CKMT)やヌクレオシド二リン酸キナーゼも同様にATP代謝に関与しており、なぜAK2変異単独でRDを引き起こすのか不明であった。また、リンパ球、好中球、マクロファージ等の免疫細胞は造血幹細胞から分化するがRDではこのうちTリンパ球と好中球の分化が特異的に障害されており、AK2と細胞特異的分化障害との関連も未解明であった。
今回、AK2や他のエネルギー代謝酵素と血球系細胞分化との関係について検討した。まず、マウス各臓器の酵素発現を調べたところ、造血系組織である骨髄でAK2発現が極めて優位であることが確認された。さらに血球系分化について、好中球およびマクロファージへ分化可能なHL-60細胞を用い、分化時の酵素発現を調べた。その結果、好中球分化ではAK2のみが発現しているが、マクロファージ分化ではAK2とCKMT1が発現しており、系統による酵素発現の違いが観察された。また、AK2ノックダウンによるRDモデルHL-60細胞を作製し分化への影響を検討したところ、マクロファージ分化効率は変化しなかったが、好中球への分化効率は有意に減少した。その際、酸化ストレスの有意な上昇が認められた。
以上より、RDにおける免疫細胞の特異的分化障害は血球細胞のミトコンドリア膜間酵素発現の違いに起因し、好中球の正常分化にはAK2が必須であることが示された。RDではAK2欠損によるATP-ADPの濃度バランス異常や、それに伴う酸化ストレスの上昇により好中球分化が障害されると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は、1) AK2欠損疾患モデル細胞の樹立、2)AK2欠損疾患モデル細胞を用いた血球系分化機構、および細網異形成症の発症機序を明らかにする予定であった。1)については、薬剤刺激によって好中球およびマクロファージに分化しうるHL-60細胞を用いて、AK2 siRNA をNucleofector II (Lonza)で導入しAK2ノックダウンを行った。これにより、bipotentに分化可能なAK2欠乏モデル細胞を樹立した。
2) においては、好中球分化ではAK2のみが発現しているが、マクロファージ分化ではAK2とCKMT1が発現することを確認した。AK2ノックダウンHL-60細胞ではマクロファージの分化効率は変化しなかったが、好中球への分化効率は有意に減少した。また、その際、酸化ストレスが有意に上昇した。したがって、ミエロイド系最終分化にはミトコンドリア膜間でのアデニンヌクレオチド代謝が必須であり、好中球においてAK2が必須であることが示された。このことは、エネルギー代謝およびミトコンドリア機能が免疫細胞分化に寄与している新たな知見であり、今後の検討につなげていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、細網異形成症の治療法開発(1、2)、エネルギー代謝と免疫細胞分化の新規知見(3)についての計画を推進する。
1) 疾患モデル細胞を用いたAK2欠損の改善検討 … 昨年度の検討で明らかになった病態メカニズムを踏まえて、ミトコンドリア機能の改善を検討するために、AK2ノックダウンHL-60細胞を用いて、改善度合いを指標に候補因子を探索することにした。候補となりうる因子で処理したAK2ノックダウンHL-60 細胞をATRAで処理することによって好中球分化を誘導し、その分化割合をNBT assayで測定し、改善度合いを検討する。AK2が恒常的かつ完全に欠損している系が必要な場合は、Zinc Finger NucleaseによってAK2をノックアウトしたHL-60細胞を作る。
2) 食品成分・栄養素での補完酵素の発現誘導によるAK2欠損の改善検討 … 別の治療法を考案するために、AK2遺伝子発現の調節機序を明らかにすることにした。さらに種々の栄養素を含む、薬物によるプロモーター活性の制御能を検索し、治療薬の候補をスクリーニングする系を構築することを計画している。まず、AK2の転写開始点をGeneRacer kitで決定し、プロモーター領域をクローニングする。候補食品成分等を用い、Luc assayによりプロモーター活性を調節しうるものをスクリーニングする。選別した有効と思われるものを用いて、分化の改善を確認する。
3) ATP-ADP代謝およびミトコンドリア機能と免疫細胞分化との関連に関する詳細な検討 … AK2が免疫細胞分化に影響を与えることが明らかとなったため、AK2ノックダウンHL-60細胞と正常なHL-60細胞でそれぞれの分化時を比較し、免疫細胞分化に関与する経路等を検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
購入したい抗体があったが、残りの金額では足りなかった。他に購入したい適当な物品もなかったため、次年度使用額が生じてしまった。
次年度分として請求した助成金とあわせて、今後の計画で使用する抗体・試薬を購入する予定。
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