2016 Fiscal Year Research-status Report
カルシウム吸収を促進する精油の探索－腸管上皮培養細胞を用いた解析
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25750064
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| Research Institution | Senri Kinran University |
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Principal Investigator |
小林 優子 千里金蘭大学, 生活科学部, 助教 (10393208)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | カルシウム吸収 / 腸管上皮細胞 / Caco-2 / 精油 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現代の日本人において、カルシウム摂取の慢性的な不足が問題となっている。本研究では、カルシウム吸収の第一段階をになう腸管上皮細胞を用いて、カルシウム吸収促進効果を簡便に判定するスクリーニング系を構築すること、そしてこの系を利用して、腸管に作用してカルシウム吸収を促進する新たな機能性成分を見出すことを目標としている。
平成28年度は、腸管上皮におけるカルシウム吸収経路のひとつである「細胞間輸送経路」の活性化因子を探索するために、腸管上皮培養細胞であるヒト結腸癌由来細胞株Caco-2を用いて、TER（経上皮電気抵抗）値を指標としたスクリーニング系の開発を開始した。TER値は、細胞間隙の透過性の指標となる数値であり、Caco-2細胞を透過性膜を持つインサート上で培養し、測定電極をインサートの内側（管腔側）と下部プレート（基底膜側）に挿入することで測定できる。TER測定のために、まずは細胞の播種数や培養日数などを検討し、十分に細胞間隙のタイトジャンクションが発達し、高いTER値が得られる条件を設定した。条件設定の後、TER値を変化させる精油のスクリーニングを開始した。具体的には、Caco-2細胞を培養しているインサートの培地に精油サンプルを添加した場合と、添加しない場合とでTER値を比較した。その結果、TER値を低下させる、すなわち細胞間隙の透過性を亢進する可能性がある数種の精油が見出された。あわせて、TER値を低下させる濃度の精油が、Caco-2細胞の生存に影響を与えないかどうか、MTT法により検証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究実施計画と照らし合わせると、腸管上皮培養細胞を用いた細胞間輸送経路活性化因子のスクリーニング系の開発は、条件設定が終了し、精油サンプルを用いたスクリーニングが開始できていることから、おおむね順調に進んでいるといえる。しかしながら、もうひとつのスクリーニング系である経細胞輸送経路活性化因子のスクリーニングについては、使用予定であった蛍光プレートリーダーが故障するというトラブルが発生したため、測定が実施できていない状況である。新規の蛍光プレートリーダーの購入検討と選定に時間を要したが、まもなく納品される予定であるため、測定が可能になり次第着手する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度に引き続き、カルシウムの細胞間輸送経路活性化因子のスクリーニングを進める。細胞間隙の透過性は、蛍光色素の透過量を指標にすることによっても測定できるため、蛍光プレートリーダーの準備が整い次第、TER値とあわせて、蛍光色素透過量の測定も開始する。平成28年度の実験により、細胞間隙の透過性を亢進する可能性が推定された精油については、Caco-2細胞に対する作用メカニズムを検討する。具体的には、活性型ビタミンDが細胞間輸送経路を調節してカルシウム吸収を促進する際に発現量が変化すると報告されている、クローディンやカドヘリンなどのタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現について解析する。また、蛍光測定による細胞内カルシウム濃度変化を指標としたスクリーニング系の条件設定も引き続き行い、カルシウムの経細胞輸送経路活性化因子の探索も進める。有効な精油が見つかれば、細胞内でカルシウム輸送に関連する遺伝子やタンパク質にどのような影響を与えるのかを解析する。上記の実験により、カルシウム吸収促進効果が見られた精油については、主要成分として報告されている化合物を単独で用いて同様のスクリーニング実験を実施し、有効成分の特定を進める。
以上の実験から得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、平成28年度中に蛍光プレートリーダーを購入する予定であっただ、購入時期が遅れたため、費用が支出されなかったことによる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は、平成29年度直接経費とあわせ、蛍光プレートリーダーの新規購入、細胞培養用プラスチック器具、細胞培養用試薬、カルシウム蛍光指示薬などの購入に使用する予定である。
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