2015 Fiscal Year Research-status Report
人工染色体ベクターを用いた巨大遺伝子のin vivo導入法の開発
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25830137
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
柏木 明子 鳥取大学, 医学部, 助教 (90335521)
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2014-02-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 人工染色体ベクター / 純化法 / 微小核細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
人工染色体ベクター（human artificial chromosome、以下HACとする）は、導入可能な遺伝子サイズに限界がなく、メガベース単位の長大遺伝子のデリバリーが可能であることから、再生医療研究、抗体医薬開発への応用など様々な分野での利用が期待されている。しかしながら、染色体であるHACを活用する際の一つの課題は、目的細胞への導入効率の低さである。細胞への染色体であるHAC導入の唯一の方法論として現在微小核融合法が使用されているため、HACのみを含む微小核細胞を濃縮した後、目的細胞と融合させることによりHACの導入効率の改善が期待できる。本研究では、この課題の改善を目的とし、HACを単独で保持する微小核細胞を濃縮し、純化する新規方法の確立を目指す。
HACのドナー細胞として、これまでチャイニーズハムスターCHO細胞等が用いられてきた。これらの細胞の染色体はサイズが小さく、染色体本数が多いため、本ベクターから分離するためには不向きである。そこで、染色体本数がわずか6本と全哺乳類中染色体本数が最少であることが知られるインドキョン線維芽細胞株FM7を本ベクターのドナー細胞に利用することにより問題解決に取り組むことにした。FM7細胞は6本の巨大染色体を持つため、HACとの染色体サイズ差を最大にできる。よって、HACのみを含む微小核の形成および分取に有効と考えた。本研究ではすでに作成済みであったHAC１本を独立に保持するFM7細胞（以下FM7-HAC細胞とする）を用いて、至適な微小核形成条件を検討した結果、細胞培地に微小管脱重合阻害薬パクリタキセルを最終濃度0.03ug/mlとなるよう添加し、48時間処理することで高率に微小核細胞が形成されることを確認した。
現在は、上記の薬剤処理により誘導、回収されるFM7-HAC細胞由来の全微小核細胞集団から、HACのみを保持する微小核細胞（以下HAC-MCとする）を効率的に濃縮、純化させる方法の開発を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の計画である、HAC-MCの濃縮、純化法の至適条件検討を様々な方法で試みたが、至適条件決定には至らなかったため。
本年度は、HAC-MCの純化法の開発を試みた。まず、フィルトレーション法を検討した。FM7-HAC細胞由来の全微小核細胞のうち、巨大なムンチャック染色体を含む不要微小核細胞集団とHAC-MCを、微小核細胞直径サイズ差を利用して分離し、より直径サイズの小さいHAC-MCのみをろ過し純化する方法である。様々なポアサイズのフィルターを用い、各ろ液を回収し、ゲノムPCR法、あるいはFISH法により、HAC-MCの濃縮の可否を検証した。その結果、ポアサイズが３μm以上のろ液ではHAC-MCの濃縮が確認できず、またそのポアサイズがそれより小さいフィルターでは微小核細胞のろ過効率が下がり大幅にロスするため、効率的なHAC-MCの分離は困難であると判断し、フィルトレーションによる純化条件検討を中止した。
次に、同材料を用い、手法をフィルトレーション法からFACS法に変更し検討を続けた。HACにはEGFP遺伝子が搭載されているため、FM7-HAC細胞由来の全微小核細胞は細胞質の体積の大小によりEGFP強度に差が生じることを利用した。つまり不要ムンチャック染色体を含む比較的大きな微小核はEGFP強陽性を、体積の小さいHAC-MCはEGFP弱陽性を示すと考えられ、EGFP蛍光強度差による分離を試みた。FACSによって弱陽性集団をソートした結果、デブリスの混入が予想以上に多く、HAC-MCソーティングは時間がかかり非効率であった。HAC-MCのダメージを抑えるため短時間で十分な収量を得るためには、デブリスの混入を避ける、さらなる条件検討が必要であることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度では、HAC-MC純化法開発として、FACS法と併せて、パーコール密度勾配法も検討を進める予定である。FM7由来の巨大染色体を含む微小核細胞と、約５MbのHACのみしか含まない微小核細胞では、密度に差があることが予想されるため、パーコール密度勾配法がHAC-MCの純化に有効と考えられる。FM7-HAC細胞由来の全微小核細胞とパーコールの混合液を超遠心分離する際の回転数や時間等の至適条件を検討し、HAC-MC純化法を確立したい。両純化法とも、HAC-MCの存在は今までと同様にEGFP配列によるゲノムPCR法、ヒトセントロメアプローブによるFISH法により確認し、その濃縮程度を検証していく予定である。
HAC-MC純化法が確立できれば、濃縮済みのHAC-MCと従来法により精製したHAC-MCそれぞれを用いて、任意の目的細胞へ移入し、HACの移入効率を比較する。HAC-MCの濃縮作業を経ることにより、HACの目的細胞への移入効率がどの程度改善可能かを検証したい。
さらに、濃縮させたHAC-MCにリポフェクション法等、膜融合能を付与した後、マウス個体内にin vivo導入実験を行なう。個体内におけるHACの分布についてin vivo imaging解析を行ない、in vivoでのHAC導入効率を評価したい。
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| Causes of Carryover |
当初の予定より多く細胞培養関連試薬、プラスチック製品が必要であったため購入したから。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞培養に使用し、人工染色体ベクターのみを含む微小核細胞濃縮法の確立を急ぎたい。
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