2016 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis of Wnt signaling regulation by dynamic oligomerized proteins
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25840017
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
寺脇 慎一 群馬大学, 大学院理工学府, 助教 (10452533)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Wntシグナル / DIXドメイン / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに得ていたAxin-Ccd1複合体の結晶は、低分解能の回折データしか観測できなかったため、本年度は、Ccd1とAxinとのDIXドメイン間相互作用解析を中心におこない、オリゴマー状態を均一化する変異体を同定して、結晶化に用いることでX線回折能の改良を試みた。Ccd1は、培養細胞内で過剰発現させると細胞内濃度の増大に伴いホモオリゴマー形成が促進され、βカテニン依存的な転写活性化を引き起こすが、マウス由来Ccd1(mCcd1)はゼブラフィッシュ由来Ccd1(zCcd1)と比較すると転写活性が低レベルであり、mCcd1に特異的な活性制御の存在が示唆されていた。前年度までに構造決定したmCcd1とzCcd1のホモオリゴマー構造を基にして、アラニン変異を導入し、動的光散乱分析によるホモオリゴマー形成能とプルダウンアッセイによるAxinとの結合力、培養細胞を用いた転写活性化能の比較をおこなったところ、mCcd１は自身でホモオリゴマー化を抑制して、Axinへの結合を弱めることが明らかになった。以上の結果は、論文として発表することを計画している。
さらに、同定したmCcd1 DIXドメインの自己活性阻害に必須な3つのアミノ酸残基について、それぞれアラニン変異体を用いてAxin DIXドメインとのヘテロオリゴマーの結晶化およびX線回折実験を行なったところ、分解能2.90オングストロームまでのX線回折データの収集に成功した。mCcd1とAxinのDIXドメインをサーチモデルとした分子置換法による構造解析を行い、初期モデルを構築して、精密化をおこない立体構造を決定した。構造解析からAxinとCcd1とのヘテロオリゴマー形成に関わるアミノ酸が特定できたので、今後は変異体を利用した相互作用解析等を進める。
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