2013 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリア-小胞体係留複合体構成因子Mmm1とMdm12の構造機能解析
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25840020
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
河野 慎 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (90431676)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 結晶構造解析 / リン脂質 / リポソーム |
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| Research Abstract |
ミトコンドリア（MT）と小胞体（ER）を物理的、機能的に係留する超タンパク質複合体であるERMES複合体は、両オルガネラ間のリン脂質輸送への関与が推測されている。しかしながら、その機能や分子メカニズムの詳細についての知見は乏しい。そこで本研究では、ERMES複合体構成因子の一つであるMdm12の立体構造解析を通じて、ERMES複合体が持つ機能の解明および、リン脂質輸送の分子メカニズムの解明を試みた。
K. lacts由来Mdm12コア領域のセレン誘導体を調製し、放射光を用いた単波長異常分散法による位相決定を試みた。その結果、4Å分解能での位相決定に成功した。また、リジン残基側鎖をジメチル化修飾することで、さらに反射能の高い結晶を取得し、最終的に2.25Å分解での結晶構造を得た。Mdm12の結晶構造は、TULIPドメインと呼ばれるリン脂質などを結合するタンパク質に特徴的なモチーフを有しており、さらに大腸菌に由来すると思われるリン脂質が、分子内部の疎水的なトンネル構造内に捕縛されていることが観察された。Mdm12の構造解析より、ERMES複合体は少なくともリン脂質の結合には関与すること、そしてMdm12がその中心を担う可能性が高いことが示唆された。
さらに、Mdm12の機能解析の一環として、リポソームを用いたin vitroリン脂質輸送実験を行った。蛍光ラベルしたリン脂質の蛍光を指標に、Mdm12および、もう一つのERMES複合体構成因子であるMmm1との複合体を用いて、リン脂質輸送活性を評価した。その結果、Mdm12単独であっても、リン脂質のリポソームからの引き抜きおよび、輸送活性を示すものの、Mmm1との複合体では活性が強く促進されることが示された。今後、Mdm12-Mmm1複合体の相互作用界面を決定するために、in vivoおよびin vitroでの架橋実験を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
セレン誘導体を用いた回折実験が、ネイティブ結晶と同様の条件で行うことが出来たため、結晶化からデータセット取得までが迅速であった。さらに、得られたデータは分解能は低いものの、位相の精度が比較的高く、モデル構築が数か月程度で完了できたため、予定よりも早く解析に成功した。
また、結晶構造決定のために最適化したサンプル調製系を用いることで、生化学的解析、特にリポソームを用いたin vitroリン脂質輸送系がスムーズに確立できた。現在の所、Mdm12単独は1Lの大腸菌培養液あたり10 mgほど、Mmm1との複合体も10~20 mgほど得ることが出来るようになったので、サンプルの供給の心配がなくなったことが要因であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
Mdm12の構造解析に成功したため、次にERMES複合体内における相互作用を解析する。まず、Mdm12の表面に位置するアミノ酸残基に、特異的に光架橋性アミノ酸であるp-benzoyl-phenylalanineを導入する。そのようなタンパク質を酵母内で発現させることで、ERMES複合体中に架橋基を持ったMdm12を導入する。そして、酵母に直接もしくは、アフィニティー精製したタンパク質に対してUVを照射することによって、複合体内でMdm12の空間上近傍に位置するタンパク質と共有結合を形成させる。そのような架橋産物を電気泳動により分離し、既知のERMES複合体構成因子に対する特異的な抗体を用いることで、Mdm12のどの位置が、どの構成因子と近い距離にあるかということを明らかにする。また、Mdm12は特にMmm1と複合体を形成すること、そしてこの二者複合体はin vitroで調製できることが示されたので、架橋基を導入したタンパク質をin vitroで二者複合体に組み込み、UV照射することで、Mmm1との相互作用に集中した解析を行うこともできる。in vitroの系を用いることで、架橋基の導入効率および架橋反応の効率が向上することが期待できるので、in vivoでの解析が困難な場合には解析の足掛かりとして有効であると考えられる。
さらに、他のERMES複合体構成因子であるMmm2、Gem1についても安定調製系を確立し、相互作用、構造解析を進めていく。
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Research Products
(3 results)
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[Presentation] Structural analysis of Mdm122013
Author(s)
Shin Kawano, Si-quinbala, Eri Asai, and Toshiya Endo
Organizer
DynaMito 2013: The 4th International Symposium on Dynamics of Mitochondria - from Molecular Mechanisms to Physiological Functions and Disease
Place of Presentation
沖縄
Year and Date
20131028-20131101
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