発光レポーター遺伝子による養殖魚の残留農薬モニタリング

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25850135
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 二見 邦彦 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 助教 (00513459)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ティラピア / 薬物代謝 / ルシフェラーゼ / 農薬 / 細胞

Research Abstract

食品の安全性確保は世界的に重要性が増してきており，我が国では食品中への農薬類およびそれらの代謝物の残留は，ポジティブリスト制により規制されるようになった。これにより，生産段階での適切なリスクマネジメントがより一層求められるようになった。しかしながらここ数年，一部の養殖魚から，養殖生産の過程で直接使用することはないはずの農薬類が検出された例が報告されている。大雨などによる河川や農地からの流入や，飼料の汚染による経口的な蓄積などが疑われているが，養殖魚における農薬の残留を未然に防ぐことは困難であり，十分なモニタリングがなされていることを保証するシステムを確立することが緊急の課題である。
平成25年度は，ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いた，簡便，安価で定量性の高い残留農薬モニタリングシステムを開発するための研究基盤を確立するために，発現コンストラクトの構築を行った。
まず，ティラピア遊離肝細胞に様々な農薬を曝露したところ，薬物受容体PXRの標的遺伝子の一つであるP-gp遺伝子の発現上昇がリアルタイムPCRにより確認された。そこで，ティラピアゲノムのデータベース検索およびインバースPCRによりP-gp遺伝子のプロモーター領域約6 kbをクローニングし，ホタルのルシフェラーゼ遺伝子をもつpGL3-Basicベクターにサブクローニングした。また，ティラピアPXRとそのパートナーRXRα遺伝子についてもそれぞれpBINDおよびpACTベクターにサブクローニングし，ツーハイブリッドシステム用のコンストラクトを作製した。作製したベクターは，Midiprep法により大量調整した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在のところ，当初の研究目的はおおむね順調に進展している。まず，ティラピアゲノムのデータベース検索およびインバースPCRにより，薬物受容体PXRの標的遺伝子の一つである薬物トランスポーターP-gp遺伝子のプロモーター領域をクローニングし，ホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結させたレポーターコンストラクトを作製することができた。薬物受容体には，PXRの他にAhRやPPARαなどもあるが，ティラピア遊離肝細胞に様々な農薬を曝露したところ，主にPXRの標的遺伝子の発現上昇が見られたことから，研究の対象をPXRおよびその関連遺伝子に絞り込むことができた。農薬の種類によっては，AhRの標的遺伝子の発現も誘導したが，これらの関連遺伝子の発現コンストラクトについては，平成26年度に作製できる目途が立った。
また，当初の計画を前倒しし，ティラピアPXR，RXRα遺伝子をそれぞれpBINDおよびpACTベクターにサブクローニングしたツーハイブリッドシステム用のコンストラクトも作製することができた。
なお，候補遺伝子アプローチにより，農薬曝露で特異的に発現が上昇する遺伝子としてPXRの標的遺伝子が同定されたため，当初予定していたSupression Subtractive Hybridization法による網羅的スクリーニングを行わなかったが，エンドスルファンを経口投与したティラピアの全RNAはすでに抽出済のため，必要に応じて次世代シークエンサーを用いた網羅的スクリーニングを行うことも可能となった。

Strategy for Future Research Activity

平成25年度に作製したpGL3-P-gp-promoterを，マルチウェルプレートに播種した魚類培養細胞株EPCにトランスフェクションし，種々の農薬添加後のルシフェラーゼ発光量をルシフェラーゼアッセイにより測定する。なお，予備実験の段階では農薬LC/MS Mixなども用いる。ここでは，曝露農薬との用量反応関係についても検討する。必要に応じて，AhRとそのパートナーArntの発現コンストラクト，および標的遺伝子であるCYP1Aのプロモーターの下流にホタルのルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーターコンストラクトの構築なども行う。
本研究では，汚染した養殖魚の血液や組織ホモジネートの濾液をマルチウェルプレートに播種した魚類培養細胞に添加し，ルシフェラーゼ発光量を測定するといったシステムを開発することを目的としていることから，血液や組織ホモジネートの前処理方法の検討も行う。血液や組織ホモジネートをCell Strainerや金属メッシュで濾過したものや固相抽出したものなどを上記の培養細胞に加え，MTT法による細胞毒性試験およびルシフェラーゼアッセイを行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

候補遺伝子アプローチにより，農薬曝露で特異的に発現が上昇する遺伝子としてPXRの標的遺伝子が同定されたため，当初予定していたSupression Subtractive Hybridization法による網羅的スクリーニングを行わなかったため。
エンドスルファンを経口投与したティラピアの肝臓から全RNAを抽出した。今後，次世代シークエンサーを用いて，エンドスルファン曝露で特異的に発現が上昇する遺伝子の網羅的解析を行う。