2013 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子工学を活用したhuperzine Aの新規供給システムの確立
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25860080
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
石内 勘一郎 日本大学, 薬学部, 助教 (70608140)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | huperzine A / アルツハイマー病 / 植物内生糸状菌 / 生合成遺伝子 / 生物合成 / Lycopodium alkaloid / serralongamine A |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、遺伝子工学的手法を用いることで、アルハイマー病治療候補薬であるhuperzine A (HupA)の生物合成による新規大量供給法を確立することである。HupAは微量アルカロイド成分であり、医薬品として市場に供給可能な生産システムは確立されておらず新たな供給法の確立が急務とされている。本研究では、HupAを生産する植物内生糸状菌を獲得し、簡便な遺伝子操作を可能とするシステムを確立した後、遺伝子破壊実験によりHupAの生合成遺伝子を特定する。さらに明らかとなった生合成遺伝子をすでに確立された酵母を宿主とした異種発現システムに適用することで、HupAの大量生物合成システムの確立を目指す。
平成25年度の研究実施計画では、まず、近年報告されたHupA生産内生糸状菌獲得に関する論文の手法に従い入手可能なHupA生産種より内生菌を単離し、すでに確立されたHupAのUPLC-MS分析法を適用することでHupA生産内生糸状菌の同定を目指した。オニトウゲシバLycopodium serratum var. longipetiolatumより単離した糸状菌のエタノール抽出物においてUPLC-MS分析を行った結果、この内生糸状菌におけるHupAの生産が確認された。得られた糸状菌種を同定した結果、この糸状菌はPhoma sp.に属することが明らかとなった。また、L. serratum var. longipetiolatumのメタノール抽出物について、カラムクロマトグラフィー等の分離分析手段を用いて植物体内でのHupAの生産を確認すると共に、新規リコポジウムアルカロイドserralongamine Aの単離ならびにNMR等の分光学的手法によりその化学構造を決定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、HupA生産糸状菌を獲得しさらにゲノム配列の解読ならびに糸状菌の簡便な遺伝子操作を可能とするシステムを確立することを目標としていたが、本年度は全ての計画を達成することはできなかった。しかし本研究は、糸状菌獲得後のシステム構築に関してはすでに他の菌種において可能であることを証明済みであり、HupA生産糸状菌を実際に獲得することを最も重要な課題の一つと設定していた。本年度はこの計画を達成できたことから全体の計画としても概ね順調に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、さらなるHupA生産種の獲得と共に、得られた糸状菌のHupA生産条件について検討する。続いてHupAの生合成遺伝子の同定を目指すが、まず内生菌のゲノム配列を明らかにし、糸状菌Chaetomium globosumにおいてすでに確立された形質転換法を参考として得られるHupA生産糸状菌の形質転換システムを確立する。形質転換はプロトプラスト-PEG法で行うこととし、使用可能な選択マーカーの条件等を検討する。続いて高頻度な相同組換えを可能とするためにligD遺伝子破壊株の取得を行う。さらに栄養要求性マーカーであるpyrG遺伝子を破壊し、形質転換のマーカーリサイクルを容易に行えるようにする。得られるHupA生産糸状菌のligD/pyrG破壊株を用いて、予想されるHupA生合成遺伝子を順次破壊し、HupAの生合成に必須な遺伝子を特定する。また遺伝子破壊実験によって得られるHupA生合成中間体の構造をNMR等の分光学的手法により明らかにすることで、HupAの生合成経路の詳細を明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度の計画では、HupA生産糸状菌を獲得し、さらにゲノム配列の解読ならびに糸状菌の簡便な遺伝子操作を可能とするシステムを確立することを目標としていた。しかし、実際は目的糸状菌の獲得までしか研究が進行せず、遺伝子実験を行わなかった。これに伴い、これらの実験に必要な試薬や酵素を購入しなかったため次年度使用額が生じた。
本年度は、遺伝子工学関連試薬に対して343千円、酵素に対して600千円、有機化学関連試薬に対して200千円、ガラス器具に対して200 千円の支出を予定している。
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