2013 Fiscal Year Research-status Report
HBV感染したヒト肝細胞置換キメラマウスにおける肝線維化進展機構の解析
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25860574
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | 独立行政法人国立国際医療研究センター |
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Principal Investigator |
杉山 真也 独立行政法人国立国際医療研究センター, その他部局等, その他 (20612427)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | B型肝炎ウイルス / 自然免疫 / 肝線維化 / ヒト化マウス |
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| Research Abstract |
（１）＜血球細胞と肝細胞を用いたTLR4経路のin vitro解析＞正常マウスを用いて、肝臓内に存在している免疫担当細胞を分離回収する手法を確立した。その中から、NK細胞とマクロファージ（クッパー細胞）の分離をフローサイトメトリーにより実施した。それらをHBV発現しているマウス肝細胞やヒト初代培養肝細胞と共培養することで、サイトカインの発現をマルチサスペンションアレイで解析した。コントロールとしては、HBV発現のないマウス肝細胞とヒト初代培養肝細胞を使い、HBV感染により誘導される特異的なサイトカインの探索を実施した。線維化発現に関連するTLR4経路の関連を確認するために、抗TLR４抗体でその経路の阻害をしたサンプルも使用した。
（２）＜キメラマウスにおけるTLR4経路のin vivo解析＞前年度までにキメラマウスへin house抗TLR4抗体を投与し、その線維化阻止効果を検証する実験を終えた。その6ヶ月飼育した時点の肝組織と血清を利用して、線維化関連遺伝子とサイトカインを定量した。遺伝子発現解析では、薄切した肝組織からマイクロダイセクションにより、浸潤血球細胞、マウスもしくはヒト肝細胞を分離して核酸抽出を実施した。既に確立済みのマウスとヒトの遺伝子を分けられる種特異的なプライマーセットを利用して遺伝子発現定量解析を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画に沿って、順調に進行している。昨年度までに動物サンプルを取得しているため、迅速に遺伝子発現を検討できる環境にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）＜血球細胞と肝細胞を用いたTLR4経路のin vitro解析＞引き続き、1年目に利用したin vitroの共培養系で基礎データの収集を図る。1年目のリアルタイムPCRやBio-Plex解析で得られたスクリーニング結果等を元に、TLR4下流のシグナルが線維化関連遺伝子の発現に至る遺伝子経路を確定させる。
（２）＜キメラマウスにおけるTLR4経路のin vivo解析＞2年目以降の（1）の解析結果を検証するために、新たなHBV感染キメラマウスを準備し、（1）で得られた候補遺伝子の阻害を抗体やsiRNAを投与することで実施する。6ヶ月程度の観察を行い、肝組織の病理学的、分子生物学的な解析を実施することでその効果を確認する。
（３）＜TLR4を活性化させるリガンドの探索＞一般的にTLR4は細菌毒の認識を行なうとされているが、ウイルス感染での役割は明らかではない。本検討でその活性化を示す予備データは得られているが（研究目的参照）、この経路が活性化された原因は不明である。一方で、Imaiらは、インフルエンザでも本件と同様の現象を報告しており、それによると、ウイルス感染細胞が発生した活性酸素種により過酸化脂質が産生され、それがリガンドと
なりTLR4を活性化していた（Imai Y. et al. Cell 2008）。本件においても同様の現象が疑われるため、まずは（1）で確立した培養細胞系において、活性酸素を発生させて肝細胞で過酸化脂質が生成される状況にあるか確認する。また、キメラマウスのHBV未感染、HBV感染短期、HBV感染長期について過酸化脂質の定量と比較を行ない、リガンドとしての可能性を検討する。この検討で過酸化脂質の関連が確認できなかった場合、培養細胞系の
上清とHBV感染キメラマウス血清に含まれる因子についてTOF-MS/MS解析を行うことで網羅的な探索実験を開始する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
一部の試薬を研究施設で共同購入することによって、予定より安価に購入できた。
次年度において、研究試薬として利用する。特に動物実験に補充することで、実験計画を再考し、よりエビデンスレベルの高い研究を実施する。
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[Journal Article] Ex vivo induction of IFN-λ3 by a TLR7 agonist determines response to Peg-IFN/ribavirin therapy in chronic hepatitis C patients.2014
Author(s)
Murata K, Sugiyama M, Kimura T, Yoshio S, Kanto T, Kirikae I, Saito H, Aoki Y, Hiramine S, Matsui T, Ito K, Korenaga M, Imamura M, Masaki N, Mizokami M.
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Journal Title
J Gastroenterol
Volume: 49
Pages: 126-37
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Risk factors for long-term persistence of serum hepatitis B surface antigen following acute hepatitis B virus infection in Japanese adults.2014
Author(s)
Ito K, Yotsuyanagi H, Yatsuhashi H, Karino Y, Takikawa Y, Saito T, Arase Y, Imazeki F, Kurosaki M, Umemura T, Ichida T, Toyoda H, Yoneda M, Mita E, Yamamoto K, Michitaka K, Maeshiro T, Tanuma J, Tanaka Y, Sugiyama M, Murata K, Masaki N, Mizokami M; Japanese AHB Study Group.
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Journal Title
Hepatology.
Volume: 59
Pages: 89-97
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).2014
Author(s)
Watashi K, Sluder A, Daito T, Matsunaga S, Ryo A, Nagamori S, Iwamoto M, Nakajima S, Tsukuda S, Borroto-Esoda K, Sugiyama M, Tanaka Y, Kanai Y, Kusuhara H, Mizokami M, Wakita T.
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Journal Title
Hepatology.
Volume: 59
Pages: 1726-37
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] New susceptibility and resistance HLA-DP alleles to HBV-related diseases identified by a trans-ethnic association study in Asia.2014
Author(s)
Nishida N, Sawai H, Kashiwase K, Minami M, Sugiyama M, Seto WK, Yuen MF, Posuwan N, Poovorawan Y, Ahn SH, Han KH, Matsuura K, Tanaka Y, Kurosaki M, Asahina Y, Izumi N, Kang JH, Hige S, Ide T, Yamamoto K, Sakaida I, Murawaki Y, Itoh Y, Tamori A, Orito E, Hiasa Y et al.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 9
Pages: e86449
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Chronic hepatitis B prevalence among children and mothers: results from a nationwide, population-based survey in Lao People's Democratic Republic.2014
Author(s)
Xeuatvongsa A, Komada K, Kitamura T, Vongphrachanh P, Pathammavong C, Phounphenghak K, Sisouk T, Phonekeo D, Sengkeopaseuth B, Som-Oulay V, Ishii K, Wakita T, Sugiyama M, Hachiya M.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 9
Pages: e88829
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] IL28B polymorphisms and clinical implications for hepatitis C virus infection in Uzbekistan.2014
Author(s)
Khudayberganova D, Sugiyama M, Masaki N, Nishida N, Mukaide M, Sekler D, Latipov R, Nataliya K, Dildora S, Sharapov S, Usmanova G, Raxmanov M, Musabaev E, Mizokami M.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 9
Pages: e93011
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Hepatitis C virus kinetics by administration of pegylated interferon-α in human and chimeric mice carrying human hepatocytes with variants of the IL28B gene.2013
Author(s)
Watanabe T, Sugauchi F, Tanaka Y, Matsuura K, Yatsuhashi H, Murakami S, Iijima S, Iio E, Sugiyama M, Shimada T, Kakuni M, Kohara M, Mizokami M.
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Journal Title
Gut
Volume: 62
Pages: 1340-6
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Human blood dendritic cell antigen 3 (BDCA3)(+) dendritic cells are a potent producer of interferon-λ in response to hepatitis C virus.2013
Author(s)
Yoshio S, Kanto T, Kuroda S, Matsubara T, Higashitani K, Kakita N, Ishida H, Hiramatsu N, Nagano H, Sugiyama M, Murata K, Fukuhara T, Matsuura Y, Hayashi N, Mizokami M, Takehara T.
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Journal Title
Hepatology.
Volume: 57
Pages: 1705-15
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Polymorphisms consisting of (TA)n dinucleotide repeat near IL28B gene could improve the predictive value for HCV spontaneous clearance with IL28B SNPs.2013
Author(s)
Masaya Sugiyama, Satoshi Hiramine, Norihiro Furusyo, Akio Ido, Hirohito Tsubouchi, Hisayoshi Watanabe, Yoshiyuki Ueno, Masaaki Korenaga, Kazumoto Murata, Naohiko Masaki, Jun Hayashi, and Masashi Mizokami
Organizer
The 64th Annual Meeting of the AASLD
Place of Presentation
Washington DC
Year and Date
20131104-20131104
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