2013 Fiscal Year Research-status Report

骨基質形成と骨石灰化カップリング機構の解明－スクレロスチンを鍵分子として－

Research Project

Project/Area Number	25860858
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	窪田拓生大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (40629135)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	小児科学 / 骨代謝学 / 骨粗鬆症 / くる病 / 骨石灰化 / Wntシグナル / スクレロスチン / 骨細胞
Research Abstract	将来の骨粗鬆症予防のために、小児期の獲得骨量を高めることは重要である。骨量の獲得は骨基質の増加と骨基質への石灰化によって達成されるが、この二つの事象を結び付ける機構（カップリング機構）は明らかではない。骨細胞は骨組織に最も豊富に存在する細胞であるが、石灰化における骨細胞の直接的関与は明らかではない。そこで、骨細胞が分泌するWntシグナルを阻害するスクレロスチン（SCL）を鍵分子として、骨における石灰化分子機構を解明することが本研究の目的である。 SCLによる骨石灰化制御分子機構を解明するため、骨芽細胞による石灰化におけるSCLの影響を検討した。予備実験では、ヒト骨芽細胞株SaOS-2細胞の分化・石灰化誘導培養において石灰化と共にSCL遺伝子のSOSTやMEPEの発現が増加していくことを定量PCR法によって確認している。これらは骨細胞で発現する蛋白である。そこで、石灰化の後期過程におけるSCLの関与を検討するために、分化・石灰化誘導開始15日目からリコンビナントSCLを添加した。分化・石灰化誘導開始21日目に石灰化をアリザリンレッド染色で検討したところ、SCLによる石灰化抑制効果が見られなかった。次に、石灰化の初期過程におけるSCLの関与を検討するために、より早期の3日目からSCLの添加を開始したが、SCLによる石灰化抑制効果が見られなかった。SaOS-2細胞の石灰化能力が顕著であることが知られているため、マウス前骨芽細胞株MC3T3-E1細胞に変更した。MC3T3-E1細胞の分化・石灰化誘導培養において、SCLの添加を分化・石灰化誘導培養開始1日目から行ったが、石灰化抑制効果を認めなかった。また、骨石灰化異常症の低リン血症性くる病患者9名から血液を採取し、ELISAキットを用いて血中SCL濃度の測定を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 予備実験のSaOS-2細胞の分化・石灰化誘導培養において、石灰化と共にSCL遺伝子のSOSTやMEPEの発現増加を認めた。石灰化、骨細胞への分化モデルとして妥当と考え、同様の条件においてSCLによる石灰化抑制効果を複数回検討したが、その抑制効果が認められなかった。SaOS-2の石灰化能力がSCLによる石灰化抑制を凌駕しているためと推測された。さらに、石灰化能力がSaOS-2細胞より低いと考えられるマウス前骨芽細胞株MC3T3-E1細胞を用いて検討したが、SCLによる石灰化抑制は見られなかった。
Strategy for Future Research Activity	MC3T3-E1細胞などを用いた分化・石灰化誘導培養において、WntシグナルのリガンドであるWnt1、Wnt10bを添加し、石灰化の促進効果を検討する。Wntによる石灰化促進をSCLが抑制できるかどうかを検討する。SCLによる石灰化抑制が観察できる条件を見いだせれば、同様の条件において、石灰化に関与するALP、ENPP-1やANKの発現、さらに、石灰化阻害蛋白であるosteopontin、MGP（matrix Gla protein）、DMP1（dentin matrix protein 1）等の発現を定量PCR法及びWestern blotting法によってまず検討する。その後、研究計画を遂行していく。低リン血症性くる病、ビタミンD欠乏性くる病、低ホスファターゼ症の症例数を増やし、血中SCL濃度の測定を実施する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	当初予定していた、分子生物関連の実験（定量PCR法及びWestern blotting法、組み換え遺伝子導入実験）が実施できなかったために、25年度の研究費に未使用額が生じた。 25年度に未実施であった分子生物関連の実験（定量PCR法及びWestern blotting法、組み換え遺伝子導入実験）に必要な消耗品を購入し、26年度行う予定の研究計画と併せて実施する。