2014 Fiscal Year Research-status Report

放射線治療後の血漿中腫瘍由来DNA増加を利用した癌診断・薬剤感受性解析法の確立

Research Project

Project/Area Number	25861145
Research Institution	Tokyo Metropolitan Komagome Hospital (Clinical research laboratory)
Principal Investigator	影山俊一郎東京都立駒込病院(臨床研究室), その他部局等, その他 (60644979)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	放射線治療 / 血漿DNA / 次世代シークエンサー
Outline of Annual Research Achievements	【目的】血漿中腫瘍由来DNAは癌の診断、分子標的薬の感受性予測に有用であることが知られている。当院では放射線治療後に血中に流出する腫瘍由来DNAを用いて癌の診断、薬剤感受性予測の解析法確立を目的とした前向き観察研究を施行しており今回その中間解析を行った。【方法】2013年7月より当院にて放射線定位照射（50 Gy/4 fr, 75 Gy/25 fr）となった肺非小細胞癌患者を対象とした。放射線治療前の患者血漿を標準とし、それぞれ12.5 Gy, 25 Gy,37.5 Gy, 50 Gy照射終了時、または18 Gy, 39 Gy, 57 Gy, 75 Gy終了の時点で採血を行いDNAを単離し、総量を計測した。回収したDNAに対してPCR Invader法によりEGFR変異を調べ生検検体と比較した。【結果】肺非小細胞患者T1aN0M0 3例、T1bN0M0 1例、術後再発2例が登録,線量は50 Gy/4 frが4例、75 Gy/25 frが2例であった。放射線治療前の血漿中DNAの中央値は20.3 ng/mlであり放射線治療後の血漿中DNAの中央値は121.3 ng/mlであった。事前の生検検体よりEGFR(T790M)変異を認めた症例は1例であり、同症例では放射線治療前の血漿中DNAからはEGFR変異は検出されず、治療後の血漿中DNAからはEGFR変異が検出された。その後リアルタイムPCR、digitalPCRを用いた変異DNAの定量的な解析系の確立を行っている。【考察】放射線治療後に血液中に腫瘍由来DNAが増加することが示された。現在回収できているDNA量はngオーダーの微量であること、正常組織由来のDNAが混在していることから今後も複数の実験系を検討し感度、再現性にすぐれる検出方法で解析を行っていく。今後は症例の集積後、次世代シークエンサー解析による診断、EGFR以外の変異解析の手法を確立する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Digital PCR, 次世代シークエンス解析は一度に150万単位の費用がかかり、サンプルも一度に提出しなければならないため、症例集積後一度にサンプル提出するため解析費用は実験系が確立し、検体も出揃う最終年度予算として申請する予定である。
Strategy for Future Research Activity	・当初計画として初年度に臨床試験プロトコールの作成、倫理委員会通過後試験登録症例を15症例程度と見込んだ。結果、プロトコール作成、倫理委員会の通過までは予定通り進行したが臨床試験登録症例は8例程度、うち十分なサンプリングが可能であった症例は6症例であった。・DNA回収量が100ng前後であり、シークエンス解析には不十分であったためPCRベースの解析を先行することとした。・昨年度の成果として回収した検体を用いた解析に適した実験系の確立を行った。現在の候補としてdigital　PCRによる解析、リアルタイムPCRを用いた解析を平行して行っており、ngオーダーの微量DNAを用いても癌由来変異DNA検出が可能であることを確認している。・最終目標として血漿中DNAを用いて第次世代シークエンサー解析を行う予定であるが、現在の回収DNA量の問題より感度の高いPCRベースの解析を先行することとしている。DNA回収量の問題については第3世代シークエンサーを用いた感度上昇、放射線治療後最適化された時系列を用いた回収血液量の増加で対応していく予定である。
Causes of Carryover	Digital PCR, 次世代シークエンス解析は一度に150万単位の費用がかかり、サンプルも一度に提出しなければならないため、症例集積後一度にサンプル提出するため解析費用は実験系が確立し、検体も出揃う最終年度予算として申請する予定である。
Expenditure Plan for Carryover Budget	EGFR変異解析用のリアルタイムPCRkit, digital PCR費用、次世代シークエンス解析用として申請予定である。